重组腺病毒rAdCDglyTK的构建和体内、外抑杀瘤作用的实验研究

发布时间：2017-12-28 19:15

本文关键词：重组腺病毒rAdCDglyTK的构建和体内、外抑杀瘤作用的实验研究　出处：《天津医科大学》2007年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】： 通过自杀基因辅以前体药物进行恶性肿瘤治疗是近年来基础、临床相关医务人员研究的热点领域之一。本研究所选用课题组前期制备的含大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶(EC-CD)基因和单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)基因的重组腺病毒质粒rpAdCDglyTK，于293细胞内包装、扩增得到rAdCDglyTK。通过对融合自杀基因重组腺病毒rAdCDglyTK体内、外抑瘤作用的实验研究，比较单、融合自杀基因的抑瘤效果，为融合自杀基因rAdCDglyTK的临床应用积累的实验依据。本研究首先将课题组前期构建成功的rpAdCDglyTK的重组腺病毒质粒线性化，并用脂质体法将其转染至293细胞内包装，借助报告基因GFP表达绿色荧光蛋白以及PCR法扩增感染细胞上清液得到特异性CDglyTK条带显示包装成功。后经传代感染扩增，CsCl密度梯度离心，纯化得到高浓度的含融合自杀基因的重组腺病毒rAdCDglyTK，用TCID_(50)法确定其滴度。通过对Hela肿瘤细胞的生长抑制实验分别证明了融合自杀基因重组腺病毒rAdCDglyTK中的CD基因和TK基因具有各自的功能活性，与单自杀基因重组腺病毒rAdCD和重组腺病毒rAdTK活性没有显著差异(P＞0.05)。为了探讨融合自杀基因重组腺病毒rAdCDglyTK的体外抑杀瘤作用，将重组腺病毒rAdCDglyTK／5-FC+ACV、课题组前期成功构建的rAdCD／5-FC、rAdTK／ACV及rAdlacZ／5-FC+ACV系统分别作用于人宫颈癌细胞Hela、人肝癌细胞SMMC-7721、人肺癌细胞A549、人卵巢腺瘤SK-OV-3和人神经胶质瘤细胞U251。经48小时培养后，用MTT法检测肿瘤细胞的生长抑制率，并与rAdCD／5-FC、rAdTK／ACV、5-FC+ACV系统进行了比较。结果显示，本研究构建的重组腺病毒rAdCDglyTK对上述五种肿瘤细胞抑制作用为(54-79％)，与rAdCD／5-FC(30-46％)、rAdTK／ACV(31-45％)、rAdlacZ／5-FC+ACV(4-11％)系统相比均存在显著性差异(P＜0.05)。与正常肿瘤细胞对照亦存在显著性差异(P＜0.05)。同时探讨了重组腺病毒rAdCDglyTK的体外旁杀伤作用，将rAdCDglyTK与rAdCD、rAdTK、rAdlacZ系统分别感染人宫颈癌细胞Hela、人肝癌细胞SMMC-7721、人肺癌细胞A549、人卵巢腺瘤SK-OV-3和人神经胶质瘤细胞U251。经37℃5％CO_2孵箱培养12小时，收获细胞后，将五种感染细胞分别与相应的未感染细胞以不同比例混合，在同样条件下再培养48小时，结果发现，rAdCDglyTK系统在各混合比例感染组中抑杀瘤率均高于rAdCD、rAdTK、rAdlacZ系统，在感染比例低时(10％、25％)旁杀伤效果更为明显(P＜0.05)，，随着混合比例升高(75％)，rAdCDglyTK与rAdCD、rAdTK间不存在明显差异(P＞0.05)。为了探讨构建的重组腺病毒rAdCDglyTK的体内抑杀瘤作用，本研究将Lewis肺癌株接种到C57BL近交纯系小鼠左侧腓肠肌，并按照方案给予rAdCDglyTK、rAdCD、rAdTK、rAdlacZ病毒及对应前体药物治疗。通过观测瘤体大小、重量、中位生存期及病理学改变等，证实了实验组(给予rAdCDglyTK／5-FC+ACV)小鼠瘤体平均生长速度、瘤重明显低于荷瘤对照组rAdCD／5-FC、rAdTK／ACV、rAdlacZ／5-FC+ACV(P＜0.05)。小鼠肿瘤组织病理切片显示，实验组小鼠肿瘤组织坏死呈点灶状，而对照组肿瘤组织则出现大面积坏死，从而也证明了rAdCDglyTK较单独rAdCD、rAdTK有更好的体内抑瘤效果。本研究通过对重组腺病毒rAdCDglyTK体内、外抑杀瘤作用实验研究，探讨了rAdCDglyTK／5-FC+ACV系统有最佳杀抑肿瘤作用，此结果为今后临床应用自杀基因对肿瘤进行基因治疗奠定了坚实的实验基础。
[Abstract]:The treatment of malignant tumors by using suicide gene with precursor drugs is one of the hotspots in the research of basic and clinical related medical staff in recent years. In this study, we selected the recombinant adenovirus plasmid rpAdCDglyTK containing Escherichia coli cytosine deaminase (EC-CD) gene and herpes simplex virus thymidine kinase (HSV-TK) gene in the research group, and rAdCDglyTK was packaged and amplified in 293 cells. The anti-tumor effect of recombinant adenovirus rAdCDglyTK, a fusion suicide gene, was compared in vivo and in vitro. The anti-tumor effect of single and fusion suicide gene was compared, so as to accumulate experimental evidence for the fusion of suicide gene rAdCDglyTK.
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2007
【分类号】：R373;R346;R73-36

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