TPO受体胞内区相互作用蛋白的筛选与初步功能研究
本文关键词：TPO受体胞内区相互作用蛋白的筛选与初步功能研究 出处：《中国人民解放军军事医学科学院》2005年博士论文 论文类型：学位论文
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【摘要】：TPO是重要的造血生长因子,主要调控巨核细胞的增殖和血小板的生成,并能与其它因子协同作用,支持多能造血祖细胞的存活和分化。TPO通过与细胞膜上的TPO受体(Mpl)结合而发挥作用,研究Mpl的信号转导过程对理解TPO广泛的生理作用有重要意义。 当TPO与Mpl结合时,Mpl形成同源二聚体,激活与之结合的Janus激酶(JAK2),引起受体胞内区酪氨酸残基的磷酸化,从而引发下游STAT、Ras/Raf/MAPK、PI3K等多条信号转导通路。研究发现缺失c-Mpl胞内区近膜的10个氨基酸,TPO与c-Mpl结合便不能激活JAK2,但Raf、MAPK、PI3K仍可被激活;而去除Mpl胞内区所有酪氨酸残基,TPO仍可支持TPO依赖细胞株的增殖,这些都说明细胞内尚存在其他未被认识的TPO受体信号转导通路。寻找新的介导TPO信号的蛋白质是本研究的目的。 我们以Mpl胞内区蛋白为诱饵,利用酵母双杂交的方法从小鼠胎肝文库中钓取了16个可能同Mpl胞内区存在相互作用的基因片段;然后通过哺乳动物细胞内双杂交实验进一步筛选,去除其中2个在此系统下同Mpl没有相互作用的片段;在剩余的14个基因片段中,通过对基因的功能和细胞内定位分析,选取了8个可能同Mpl胞内区存在相互作用的基因片段继续研究,克隆了此8个基因片段的全长序列,并利用哺乳动物细胞内双杂交实验对全长基因同Mpl的相互作用进行验证,结果这8个全长基因同Mpl胞内区均存在相互作用。我们选取其中的两条基因(RACK1和Atp5d)进行了进一步研究。 RACK1是激活的PKC的受体,具有衔接蛋白的功能,已证实与许多信号分子及受体存在相互作用,可能在细胞信号转导中起组织、聚集、调控信号分子的作用。通过Western blot实验检测RACK1在不同组织与细胞内的表达情况,发现在表达Mpl的细胞和组织内RACK1的表达也很丰富;通过免疫共沉淀实验确定了在转染细胞内RACK1同Mpl胞内区存在相互作用;随后进一步用激光共聚焦
[Abstract]:......
【学位授予单位】：中国人民解放军军事医学科学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2005
【分类号】：R341
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，本文编号：1354147
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