人类A组轮状病毒Vp4的表达和抗原性研究

发布时间：2017-12-30 08:47

  本文关键词：人类A组轮状病毒Vp4的表达和抗原性研究　出处：《中国协和医科大学》2007年硕士论文　论文类型：学位论文

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【摘要】： 轮状病毒(Rotavirus RV)是呼肠病毒科(Reoviridae)轮状病毒属(Rotavirus)，是引起人类、哺乳动物类及鸟类病毒性胃肠炎的重要病原体。RV外面有三层衣壳蛋白，Vp4位于衣壳结构的最外层，从RV表面形成刺突状突起。Vp4具有血凝素作用，是病毒吸附进入细胞的功能性蛋白和病毒主要的交叉中和抗原蛋白，在RV感染和复制过程中具有重要作用，也是研究和开发RV重组疫苗的重要靶蛋白。 本研究从临床样品中分离的A组人轮状病毒TB-Chen株的Vp4基因，用特殊设计的引物进行PCR扩增，以pET作为表达载体，将Vp4蛋白编码基因序列插入到质粒pET中，构建了原核表达质粒pET-Vp4，在大肠杆菌BL21(DE3)中(不用IFFG诱导)高效表达了重组蛋白Vp4(recombinant Vp4，rVp4)。凝胶扫描分析结果显示，rVp4占菌体总蛋白的17％。Western Blot结果显示，表达的rVp4可被SA11和Wa的豚鼠免疫血清抗体特异性识别。表达的rVp4经纯化和透析复性，成功得到部分二聚体。用表达的rVp4免疫豚鼠后所得的抗体做一抗，异硫氰酸荧光素标记的羊抗豚鼠IgG做二抗进行的免疫荧光实验，可检测到在SA11和Wa株轮状病毒感染不同阶段的MA104细胞中表达的Vp4蛋白及其分布情况。研究结果说明，抗rVp4的豚鼠血清抗体能交叉识别SA11和Wa株轮状病毒的同源Vp4蛋白。SA11和Wa感染MA104细胞后，Vp4的表达量在感染12小时左右达到最高，病毒的Vp4位于细胞核周围或沿细胞膜分布；用抗rVp4的豚鼠血清所做的中和实验结果显示，抗此rVp4的抗体能阻断Wa和SA11对MA104细胞的感染。这些结果说明，本实验成功地构建了原核表达质粒pET-Vp4；所用的大肠杆菌BL21(DE3)原核表达系统是重组原核表达质粒pET-Vp4的良好表达系统，在该系统中不必用IFFG诱导；Western Blot结果说明，表达的蛋白具有良好的免疫原性，能被SA11和Wa的豚鼠抗血清特异识别；同源对比分析发现TB-Chen株的Vp4基因和氨基酸序列与Wa和SA11的Vp4基因和氨基酸序列同源性并不是很高，但重组表达的rVp4的豚鼠血清抗体所做的免疫荧光实验提示，TB-Chen株的Vp4基因和Wa和SA11株RV的Vp4基因具有高度同源的抗原表位和中和抗原表位；对rVp4进行的复性试验表明目前所用的复性条件并不是最理想的，，并且复性后所得的二聚体是不是与TB-Chen株天然状况下二聚体Vp4相同，有待进一步证明。总之，本研究为A组轮状病毒外壳蛋白Vp4的生物学和免疫学功能方面的研究打下了坚实的基础，也为A组轮状病毒蛋白质亚单位疫苗进一步的研究提供了重要的实验数据。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：中国协和医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2007
【分类号】：R373

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本文编号：1354201