PRAK相互作用蛋白的酵母双杂交筛选及DJ-1与PRAK相互作用的研究

发布时间：2017-12-30 14:38

本文关键词：PRAK相互作用蛋白的酵母双杂交筛选及DJ-1与PRAK相互作用的研究　出处：《第一军医大学》2006年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】： p38丝裂原蛋白激活激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)是一种应激激活的丝／苏氨酸蛋白激酶，属于MAPK超家族；目前已发现p38 MAPK家族成员有p38α、p38β、p38γ、p38δ，分子量约38～40 kD。各个亚型之间的不同功能部分与它们在不同组织的表达，激活方式以及底物特异性相关，不同的p38能被细胞应激(紫外线辐射、渗透性休克、热休克、脂多糖、蛋白合成抑制剂)、某些细胞因子如IL-1、TNF-α等激活。细胞应激或细胞表面受体与配体的结合介导p38的激活是一种由特定的激酶通过一种高度保守的三级激酶模式(MKKK／MKK／MAPK)而激活的过程。p38是在苏氨酸(threonine，Thr)-甘氨酸(glycine，Gly)-酪氨酸(tyrosine，Tyr)活化基团中Thr和Tyr双位点上被磷酸化而激活。能磷酸化激活p38的蛋白激酶有丝裂原激活蛋白激酶激酶3(mitogen-activated protein kinase kinase 3，MKK3)和MKK6。这两种MKK都能被转化生长因子β激活激酶1(transforming growthfactor-β-activated kinase 1，TAK1)、凋亡信号通路调控激酶1(apoptosissignal-regulating kinase 1，ASK1)、含SH3结构域富含脯氨酸的蛋白激酶(Srchomology domain 3-containing proline-rich protein kinase，SPRK)、p21激活激酶(p21-activated kinase，PAK)等激活。 p38被激活后将磷酸化一些特异性底物，包括多种转录因子，如转录激活因子2(activating transcription factor 2，ATF2)、C／EBP-β和C／EBP同源蛋白10(C／EBPbetaand C／EBP-homologous protein 10，CHOP10)、肌细胞结合增强因子2C(myocyteenhancer binding factor-2C，MEF2C)、Myc相关因子x(Myc-associated factor X，Max)，蛋白激酶，如MAPK激活蛋白激酶2(mitogen-activated protein kinase-activatcd protein kinase 2，MAPKAPK2)和MAPKAPK3、p38调控激活蛋白激酶(p38-regulated／activated protein kinase，PRAK)、MAPK作用激酶1(MAP kinase integrating kinase,，MNK1)和MNK2等。由于p38能磷酸化许多不同的底物，因而有理由认为p38具有许多不同的生物学功能。p38 MAPK的激活涉及到细胞生长、细胞周期、细胞凋亡等过程。同时，也涉及到炎症和应激反应的调控、转录因子的调控、细胞骨架重组等，在多种疾病过程都发挥重要作用，如在心肌肥大、缺血／再灌注损伤、神经元病理、感染性疾病、创伤愈合和组织重塑中等。 PRAK是一个受p38调控的丝氨酸／苏氨酸激酶，由471个氨基酸组成，分子量约54 kD；有关PRAK的功能研究目前存在着一些争议，一些研究认为在细胞应激和致炎因子的刺激下，细胞中的PRAK能被p38磷酸化激活，被激活的PRAK转而磷酸化激活小分子量热休克蛋白27(heat shock protein 27，HSP27)，从而介导细胞骨架重构，参与细胞应激反应。但近年来，另一些研究发现PRAK能够被非典型的MAPK家族成员ERK3磷酸化激活，而p38α／β对PRAK的磷酸化激活只有当p38和PRAK都在哺乳动物细胞中过度表达时才会发生。这一结果提示，PRAK在体内可能参与了ERK3信号传导通路，而在正常生理状况下p38可能并不是PRAK的上游调控激酶。另外，有关HSP27是否是PRAK的底物，目前也存在着争议，有研究发现重组的GST-PRAK在体外虽然能被p38激活并磷酸化HSP27，但通过免疫共沉淀得到的内源性PRAK在体外并不能磷酸化HSP27。在受到NaAsO_2刺激的野生型和PRAK缺陷型细胞中，都能检测到相近程度的HSP27的激活，提示HSP27在细胞内的激活可能并不完全受PRAK的调控。因此HSP27是否是PRAK的底物以及PRAK的底物到底有那些蛋白还需要进一步的研究证实。内源性PRAK主要定位于胞质中；而外源性表达的PRAK则主要位于细胞核中。序列分析表明，PRAK同时含有一个核输出信号(nuclaer export sequence，NES)和一个核定位信号(nuclear localization sequence，NLS)，而这两者对于PRAK的穿梭而言是必不可少的。在受到刺激后，由于PRAK入核减少而出核增加，导致核中的PRAK减少。PRAK的入核不依赖于p38的激活，但出核则依赖于p38对其磷酸化。因而，PRAK的亚细胞分布由多种因素决定，而且PRAK在胞质与胞核之间的穿梭到底介导哪些细胞功能也不清楚。可以看出，p38 MAPK信号通路具有广泛和复杂的生物学功能，PRAK作为该通路中的重要成员一直是研究的热点。但目前我们对其认识还十分有限，并且在许多问题上还存在着一些争议。为了进一步研究PRAK的功能，及其可能的下游底物和上游激酶，我们利用酵母双杂交筛选系统筛选了与PRAK相结合的蛋白。酵母双杂交是研究蛋白质相互作用的重要方法和手段。该方法的基本原理是利用转录激活因子(transcription activator，TA)的DNA结合结构域(DNA-binding domain，BD)和DNA激活结构域(DNA-activating domain，AD)可以分为两个空间上相互独立的功能单位这一特性，将“诱饵”蛋白与BD相融合，将可能与之相互作用的蛋白或被筛选的文库与AD融合。如果两者之间在酵母细胞内有相互作用，即使AD和BD在空间上相互靠近，启动下游的报告基因。目前这一系统被广泛应用于文库筛选、蛋白质相互作用鉴定以及蛋白质相互作用的结构域鉴定等方面。相比于其他方法，酵母双杂交系统具有更能模拟真核细胞内的作用环境、敏感性高、特异性好、高效等特点；而且经改进后的一些双杂交系统还能应用于膜蛋白之间相互作用、转录后修饰的蛋白质之间相互作用的验证，以及蛋白复合体之间相互作用的验证等。经过筛选，我们共得到3个可能与PRAK结合的蛋白，分别是MASP1(homo sapiens mannan-binding lectin serine protease 1)、SEPT8(homo sapiens septin 8)和DJ-1。DJ-1基因是由Daisuke Nagakubo等人在1997年发现的一种新的丝裂原依赖性癌基因，，其编码的DJ-1蛋白能够协同Ras蛋白引起小鼠NIH3T3细胞的转化。该蛋白广泛表达于人体各种组织，尤其在睾丸、前列腺、骨骼肌、肾脏、心脏、肝脏等组织中，表达量较高，并以二聚体的形式参与细胞的多种生命活动，如肿瘤发生、受精、雄激素受体调控、分子伴侣、抗氧化以及调控RNA结合复合体与RNA的结合等。已经有文献报道PRAK能够被H_2O_2刺激激活，并且参与了人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cell，HUVEC)在氧应激时应力纤维的形成。而DJ-1在氧化应激时，能通过“扮演”分子伴侣、清道夫蛋白以及以致凋亡通路等多种方式有效地保护细胞抵抗氧自由基的损伤。在抑制细胞凋亡方面，DJ-1主要是通过与细胞核中Fas死亡结构域相关蛋白(Fas death domain-associated protein，Daxx)蛋白结合，抑制其出核，阻断下游激酶ASK1的激活，最终抑制凋亡途径。但DJ-1序列中并没有NLS，因此DJ-1如何入核一直是一个迷。根据前期研究和我们筛选的结果，我们提出了关于DJ-1与PRAK的设想，即在氧化应激时，细胞内的PRAK和DJ-1会被激活，表达量上调，这时胞浆中的部分DJ-1就会与PRAK结合，并被PRAK通过某种方式携带入细胞核，进入细胞核的DJ-1就能与核内的Daxx蛋白结合并抑制其进入胞浆，使得胞浆中的ASK1激酶不能被激活，最终起到抑制细胞凋亡，保护细胞的抗氧化的功能。如果上述假设能够得到证实，对有关DJ-1和PRAK的功能研究具有重要意义，并且能够以DJ-1和PRAK为切入点将p38信号通路与细胞凋亡途径联系起来。为此我们对DJ-1的定位、移位、抗氧化应激功能和DJ-1与PRAK的相互作用进行了初步研究，结果发现DJ-1与PRAK在体外可以特异性地结合。随后，我们通过绿色荧光蛋白示踪的方法发现，在正常情况下，DJ-1在细胞的胞浆、胞核都有表达，但以胞浆居多；在血清以及H_2O_2刺激情况下部分细胞中的DJ-1会从胞浆移位到胞核，这初步证实了我们关于DJ-1在氧化应激的情况下会入核的假设。免疫荧光发现，HA-PRAK和pEGFP-DJ-1在部分NIH3T3细胞的胞核中存在共定位，推测PRAK与DJ-1的共定位与细胞周期有关，因为有文献报道，DJ-1的在血清刺激下的入核与细胞周期有关。我们还发现，当和HA-PRAK共转时，胞核中EGFP-DJ-1的表达量有一定程度的升高，这一现象进一步被核质分离实验所证实，这提示DJ-1和PRAK在胞核中存在相互作用。但是Flag-DJ-1与HA-PRAK在NIH3T3以及HEK293细胞中的免疫共沉淀未能测到阳性结果，这可能与我们所推测的PRAK与DJ-1仅在细胞周期的某一特定时期，才在细胞核内有共定位有关，因此我们还需要进一步改进实验方法和条件，以获得确切的实验结果。最后我们将HEK293细胞转染pcDNA3-Flag-DJ-1作为实验组，转染pcDNA3-Flag空载体和不转染组作为两个阴性对照，采用不同浓度的H_2O_2刺激24h，通过MTT检测发现，与两个对照组相比，在200～600μmol／L浓度的H_2O_2范围内，pcDNA3-Flag-DJ-1转染组的细胞活力明显较好，提示在该H_2O_2浓度刺激范围内，Flag-DJ-1能有效地保护细胞抵抗氧化应激。综上所述，我们利用酵母双杂交筛选系统，以PRAK为靶蛋白，筛选了人心脏cDNA文库，得到3个可能与其相互作用的蛋白，为下一步深入研究PRAK功能和调节机制提供新的切入点；同时将筛选到的一个可能与PRAK有结合的蛋白DJ-1，克隆到真核以及原核表达载体上，做了体内、体外的结合实验，证实两者在体外能够特异性结合；并在NIH3T3细胞核中存在共定位，过度表达的PRAK还能够影响DJ-1的亚细胞定位，促进DJ-1移位入核。最后，还对DJ-1在真核细胞中的表达定位及与应激刺激关系作了初步探讨，发现在静息状态下，DJ-1弥散分布在细胞的胞浆、胞核，但以胞浆为主。在受到血清以及H_2O_2刺激以后，部分细胞中的DJ-1会从胞浆移位到胞核。最后我们还通过XTT实验证实，在200-600μmol／L浓度范围内的H_2O_2刺激下，DJ-1能有效地保护细胞抵抗氧化应激。
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【学位授予单位】：第一军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2006
【分类号】：R363

【参考文献】