LPS预处理PMNs提取液对脑微血管内皮细胞通透性的影响及机制研究

发布时间：2017-12-31 11:44

  本文关键词：LPS预处理PMNs提取液对脑微血管内皮细胞通透性的影响及机制研究　出处：《中南大学》2007年硕士论文　论文类型：学位论文

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【摘要】： 目的脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)进入体内后,刺激单核—巨噬细胞(如单核细胞、巨噬细胞、淋巴细胞)和血管内皮细胞,释放前炎症介质,这些细胞因子和细胞活性物质进一步活化多形核中性粒细胞(polymorphonuclear neutrophils,PMNs)等炎症效应细胞,参与炎症性疾病的发生发展过程。谷氨酸(glutamate,Glu)是广泛分布于中枢神经系统(center nerve system,CNS)的兴奋性氨基酸,通过作用于神经元上的Glu受体发挥生理作用。N-甲基-D-天冬氨酸受体(N-methyl-D-aspartate receptor,NMDAR)是离子型的Glu受体之一,介导由Glu及其他相关内源性酸性氨基酸的兴奋作用。已有的研究证实,高浓度的Glu的神经毒性作用是导致感染性脑损伤的重要原因之一。最近研究发现,经甲酰甲硫氨酸-亮氨酸-苯丙氨酸(formylmethionyl leucyl phenylalanine,fMLF)处理的人PMNs可以释放Glu,并参与脑微血管内皮细胞(brain microvascularendothelial cells,BMECs)通透性的调节。那么,在CNS感染性疾病的发生发展中,LPS刺激PMNs后能否产生Glu并作用于相应的NMDAR使BMECs通透性发生改变?目前国内外尚未见相关报道。本实验通过了解经LPS预处理PMNs提取液对大鼠BMECs通透性改变的影响,来探讨感染性脑水肿脑损伤早期血脑屏障(blood brain barrier,BBB)通透性改变的可能机制。 方法1.用Percoll非连续密度梯度沉降法分离、提纯健康志愿者外周静脉血PMNs,瑞氏染色观察PMNs形态,台盼蓝染色检测细胞活性。2.用100μg/ml LPS预处理PMNs后置于37℃5%CO_2恒温培养箱,分别于5、15、30、45、60、90 min 6个时间点离心后提取无细胞上清液,LC-6A高效液相色谱荧光检测法测定其Glu浓度。3.原代分离、纯化培养大鼠BMECs,Ⅷ因子鉴定其细胞属性。4.将体外培养的单层BMECs分为6组:正常对照组,LPS预处理PMN提取液组,LPS预处理组,PMNs提取液预处理组,MK-801预处理组,Glu预处理组,分别给予相应预处理后,γ计数仪检测~(125)I-牛血清白蛋白(~(125)I-BSA)通过量评价BMECs通透性。5.Western-blotting检测正常对照组、LPS预处理PMNs提取液组、LPS预处理组、PMNs提取液预处理组、Glu预处理组、阳性对照组BMECs上NMDAR1的表达变化。 结果1.外周静脉血PMNs瑞氏染色可见大量的分叶核的中性粒细胞,PMNs纯度为97.6%±0.57%,PMNs的回收率为89.7%±7.4%,台盼蓝染色活率＞98%,PMNs形态改变＜8%。2.LPS预处理PMNs 5 min亚组Glu浓度最高为6.319±1.454(μmol/L),与正常对照组比较差异有显著性意义(P＜0.01);3.Ⅷ因子免疫组化显示,95%以上的分离细胞胞浆呈现黄色(DAB显色),而无单抗组无显色,表明培养的细胞95%以上属于BMECs。4.正常对照组,LPS预处理PMN提取液组,LPS预处理组,PMNs提取液预处理组,MK-801预处理组,Glu预处理组分别干预240min后,BMECs对~(125)I-BSA通透性指标Bake均数分别为:339.67±17.74、831.17±10.15、737.17±14.63、495.5±10.56、423.83±10.63、903.67±40.63,LPS预处理PMNs提取液组较正常对照组比较差异有显著性意义(P＜0.01);5.Western-blotting证实LPS预处理PMNs提取液组NMDAR1表达明显上调,其OD值为14.966±1.403(正常对照组条带为1,作为参照值),与正常对照组、LPS预处理组、PMNs提取液预处理组比较差异均有显著性意义(P＜0.01)。 结论本研究首次证实:LPS预处理可以使PMNs释放高浓度Glu,而PMNs释放的Glu可导致BMECs通透性增加,促使BBB屏障功能改变,其机制可能与BMECs上的NMDAR1的表达上调有关。
[Abstract]:The purpose of lipopolysaccharide (lipopolysaccharide, LPS) into the body after the stimulation of monocyte macrophage (monocytes, macrophages, lymphocytes) and vascular endothelial cells, release of proinflammatory cytokines and cell activity, these substances will activate pleomorphic cells in nuclear particles (polymorphonuclear neutrophils, PMNs) and other inflammatory cells. The occurrence and development process involved in inflammatory disease. Glutamate (glutamate, Glu) is widely distributed in the central nervous system (center nerve system, CNS) of the excitatory amino acids, by acting on the neuronal Glu receptor play a physiological role of.N- methyl -D- aspartate receptor (N-methyl-D-aspartate, receptor, NMDAR) is one of the ionotropic Glu receptor mediated. Guided by the excitatory effect of Glu and other related endogenous acidic amino acids. Research has confirmed that the neurotoxic effects of high concentrations of Glu is the result of feeling With one of the important reasons for brain injury. Recent studies found that the fmet Leu Phe (formylmethionyl leucyl, phenylalanine, fMLF) treated human PMNs can release Glu, and participate in brain microvascular endothelial cells (brain microvascularendothelial cells, BMECs) permeability regulation. Then, CNS in the occurrence and development of infectious diseases in LPS, Glu and PMNs after stimulation can produce effects on NMDAR BMECs permeability change? There is no related reports. In this experiment, through the understanding of pretreatment with LPS PMNs extract effect on the permeability of BMECs rats, to investigate the infection of brain edema in early stage of brain injury of blood brain barrier (blood brain barrier, BBB) the mechanism of the permeability change.
Methods 1. Percoll discontinuous density gradient sedimentation separation, purification of PMNs venous blood from healthy volunteers peripheral, the morphology of PMNs was observed with Wright staining, trypan blue staining was used to detect the activity of.2. cells with 100 g/ml LPS after PMNs pretreatment in 37 DEG 5%CO_2 incubator, 5,15,30,45,60,90 min respectively in the 6 time points after centrifugal extraction cell free supernatant, determination of fluorescence detection in high performance liquid chromatography LC-6A the concentration of Glu.3. in primary cultured rat BMECs isolation, purification and identification of the properties of the.4. cell factor in vitro monolayer BMECs were divided into 6 groups: normal control group, LPS pretreatment PMN extract group, LPS pretreatment group, PMNs extract pretreatment group, MK-801 pretreatment group, Glu pretreatment group were given corresponding pretreatment, gamma counter detection of ~ (125) I- bovine serum albumin (~ (125) I-BSA) by evaluating the permeability of BMECs.5.Western-blotting detection of the normal control group LPS pretreated PMNs extract group, LPS preconditioning group, PMNs extract pretreatment group, Glu preconditioning group, and positive control group BMECs NMDAR1 expression changes.
Results 1. peripheral blood neutrophil PMNs Wright staining showed a large number of lobocytes, the purity of PMNs was 97.6% + 0.57%, the recovery rate of PMNs was 89.7% + 7.4%, trypan blue staining of live rate was over 98%, the changes of PMNs < 8%.2.LPS pretreatment PMNs 5 min subgroups were the highest Glu concentration was 6.319 + 1.454 (mol/L), there was significant difference compared with the normal control group (P < 0.01); 3. factor immunohistochemistry showed that the separation of cells more than 95% yellow (DAB color), and no mAb group showed no color, showed that more than 95% cultured cells were BMECs.4. normal control group LPS, PMN extracts pretreatment group, LPS pretreatment group, PMNs extracts pretreatment group, MK-801 pretreatment group, Glu pretreatment group respectively after 240Min intervention, BMECs ~ (125) I-BSA permeability indexes of Bake were respectively: 339.67 + 17.74831.17 + 10.15737.17 + 14.63495.5 + 10.56423.83 + 10.63903.67 + 40.63 LPS, PMNs extracts pretreatment group than in the control group had significant difference (P < 0.01); 5.Western-blotting confirmed that LPS pretreatment PMNs extract group NMDAR1 expression was significantly increased, the OD value was 14.966 + 1.403 (normal control group with 1 as the reference value), and the normal control group, LPS the pretreatment group, PMNs extracts pretreatment group was significantly different (P < 0.01).
Conclusion this study confirms for the first time that LPS pretreatment can make PMNs release high concentration Glu, while PMNs released Glu can increase BMECs permeability and promote BBB barrier function. The mechanism may be related to the up regulation of NMDAR1 expression on BMECs.

【学位授予单位】：中南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2007
【分类号】：R363

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本文编号：1359641