HpaA-VacA IgY体内抗H.pylori感染及生物利用度的研究

发布时间：2018-01-01 18:30

本文关键词：HpaA-VacA IgY体内抗H.pylori感染及生物利用度的研究　出处：《重庆医科大学》2007年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】： 目的:用pQE30-HpaA-VacA-DH5a菌大量表达幽门螺杆菌(Helicobfacter pylori H.pylori)黏附素(HpaA)与细胞空泡毒素(VacA)的重组蛋白HpaA-VacA,以此重组蛋白为抗原,制备高效价的幽门螺杆菌重组蛋白卵黄抗体(HpaA VacA IgY)。方法: 1、大量培养重组菌pQE30-HpaA-VacA-DH5a,诱导表达重组蛋白HpaA-VacA,SDS-PAGE分析其表达形式,经Ni2+-NTA树脂纯化后,Bradford法测定蛋白浓度,ELISA法鉴定其免疫原性。 2、用纯化的重组蛋白免疫产蛋母鸡,制备HpaA-VacA IgY,建立检测HpaA-VacA IgY的ELISA法,测定其效价;将高效价的IgY混合,饱和硫酸铵法纯化后,SDS-PAGE测定纯度,Bradford法测定蛋白含量,ELISA法鉴定IgY的特异性。结果: 1.SDS-PAGE电泳显示目的蛋白相对分子量为65000,主要以包涵体形式表达,经NI2+-NTA柱纯化后,纯度达90%以上,Bradford法测得蛋白质含量为1.2mg/ml。 2.免疫原性鉴定结果显示重组蛋白HpaA VacA分别具有HpaA和VacA的抗原特异性 3.获得的HpaA VacA IgY经浓缩纯化后,效价为1:12800,蛋白浓度为19mg/ml,并同时具有针对HpaA和VacA抗原结合的特异性,效价分别为6400和3200。结论:成功地获得了较高浓度和纯度的重组蛋白HpaA-VacA,并制备了高浓度、较高效价的特异性HpaA-VacA IgY,该IgY同时具有针对HpaA和VacA抗原结合的特异性。第二部分HpaA-VacA IgY体内抗H.pylori感染的研究目的:通过给Balb/c小鼠口服HpaA-VacA IgY,观察防治H.pylori感染的效果,找出其预防和治疗H.pylori感染的最低浓度,以评价其防治H.pylori感染的可行性,为制备集治疗和预防为一体的抗H.pylori感染的的双效性制剂奠定基础。方法:将Balb/c小鼠随机分成四组:阳性对照组(H.pylori感染组)、阴性对照组、治疗组和预防组,按HpaA-VacA IgY剂量不同将治疗组和预防组再分别分为六组即PBS对照,1,2,4,6,和8mg/ml组。阳性对照组:分3次给小鼠灌喂H.pylori,每次间隔1天,于末次灌喂4周,8周和12周分别处死小鼠,检测感染情况;阴性对照组:用布氏肉汤代替H.pylori用与阳性对照组相同的方法给小鼠灌喂;治疗组:感染H.pylori的方法同阳性对照组,4周后给小鼠灌喂HpaA-VacA IgY,每次间隔1天,共3次,隔8周后处死小鼠,检测感染情况和炎症反应情况;预防组:给小鼠灌喂HpaA-VacA IgY,半小时后再给小鼠灌喂H.pylori,每次间隔1天,共3次,于末次灌喂12周后处死小鼠,检测H.pylori感染情况,计算预防率。以快速尿酶试验,小鼠胃黏膜细菌培养,胃黏膜组织切片姬姆萨染色镜检判定H.pylori感染,胃黏膜组织HE染色判定胃黏膜炎症。结果:H.pylori感染组的总感染率为70.4%,HpaA-VacA IgY剂量为6mg/ml时可以达到效理想的预防效果,8mg/ml时可以达到效理想的治疗效果。结论:成功地建立了H.pylori感染的Balb/c小鼠模型,口服抗体制剂HpaA VacA IgY对小鼠H.pylori感染有预防和治疗双重作用,为制备集预防和治疗于一体的抗H.pylori感染的双效性制剂奠定基础。第三部分: HpaA-VacA IgY生物利用度的初步探讨目的: ELISA法检测不同酸性条件下含有不同种类糖的HpaA-VacA IgY的抗体活性,探讨糖类在酸性环境下对IgY的保护作用;测定不同时间HpaA-VacA IgY在胃内的滞留量和抗体活性,在胃粘膜表面的抗体活性。为评价特异性IgY防治H.pylori感染的生物利用度,寻找提高HpaA-VacA IgY生物利用度的途径奠定基础。方法: 1、在HpaA-VacA IgY中分别加入菊糖,山梨醇,葡萄糖,蔗糖,葡聚糖,分别置于PH 1.0,2.0,3.0条件下37℃维持2h后,ELISA法检测IgY的抗体活性,以评价糖在酸性条件下对IgY的保护作用。 2、在HpaA-VacA IgY中分别加入不同含量(10%,15%,20%,25%,30%,40%,50%)的山梨醇和菊糖,置于PH 2.0条件下37℃维持2h后,ELISA法检测IgY的抗体活性,以评价山梨醇和菊糖在酸性条件下对IgY的保护作用。 3、将HpaA-VacA IgY灌胃家兔,间隔一定时间抽出胃内液体,测量体积,测定PH值, ELISA法检测抗体活性,取胃窦和胃体部的黏膜,ELISA法检测抗体活性,以评价IgY的胃内滞留量和抗体活性。结果: 1.在酸性条件下,多种糖对HpaA-VacA IgY抗体活性均有一定的保护作用,其中山梨醇的作用最强,菊糖其次。 2.PH=2.0时, 40%山梨醇30%菊糖对IgY的保护作用最强。 3.在给家兔灌喂后1h、4h和7.5h,HpaA-VacA IgY在胃腔内的滞留量分别为注入量的68.8%、46%和14%。 4.在给家兔灌喂后40min,4h,7.5h,HpaA-VacA IgY的抗体活性分别为原来的68.8%、47.6%和29.1%。 5.注入HpaA-VacA IgY后,家兔胃内的PH值在5.0-7.0之间波动,在3h时PH值最低(5.0)。 6.在胃窦和胃体黏膜均未检测到HpaA-VacA IgY的抗体活性。结论: 1、在酸性条件下,各种糖对HpaA-VacA IgY均有一定的保护作用,其中山梨醇和菊糖的保护作用最强;在PH2.0条件下,40%山梨醇30%菊糖对IgY的保护作用最强。 2、HpaA-VacA IgY在家兔胃内不同时间有不同的的滞留量,但滞留时间约为7.5h;随时间的推移,HpaA-VacA IgY抗体活性逐渐下降,到7.5h时为原来的29.1%,胃窦和胃体黏膜未测出IgY活性;注入HpaA-VacA IgY后,胃内PH值在5.0-7.0之间波动,最低为5.0。 3、本实验为评价特异性HpaA-VacA IgY防治H.pylori感染的生物利用度,寻找提高IgY生物利用度的途径奠定了基础。
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【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2007
【分类号】：R392

【参考文献】