转人端粒酶基因骨髓间充质干细胞的构建及其细胞特征分析

发布时间：2018-01-02 10:11

本文关键词：转人端粒酶基因骨髓间充质干细胞的构建及其细胞特征分析　出处：《浙江大学》2007年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】： 端粒酶是一种由RNA和蛋白质两种组份构成的核糖核蛋白复合体,其中RNA组份是端粒酶复制时用的模板,蛋白质组分主要是端粒酶催化亚单位,又叫做端粒酶逆转录酶(hTERT),它的功能是利用RNA模板复制端粒的重复片段,延长端粒。端粒的长度和细胞分裂时端粒损失的速度决定了不表达端粒酶细胞的衰老和寿命,而在表达端粒酶的细胞中端粒酶能补充端粒长度,使细胞的生命延长甚至永生。骨髓间充质干细胞(hMSCs)在细胞移植,基因治疗,组织工程方面有重要作用,但是骨髓间充质干细胞体外增殖能力弱,传代能力差。延长骨髓间充质干细胞的生命周期能弥补骨髓间充质干细胞来源的不足,具有重要的实际意义。因此,本研究制备了表达hTERT基因的重组逆转录病毒,在分离培养骨髓间充质干细胞的基础上,将hTERT基因导入骨髓间充质干细胞中,并传代290代以上。在传代过程中,对转导hTERT基因的细胞进行了功能和特性的分析。目的:通过重组逆转录病毒技术体外转导hTERT基因,建立过表达端粒酶的hMSCs,经传代培养观察过表达端粒酶的hMSCs分裂和增殖能力以及细胞生命周期变化。阐明使用hTERT作为目的基因能否延长hMSCs的生命周期,并研究过表达端粒酶hMSCs的表面抗原,细胞核型特征与致瘤性,向脂肪细胞、软骨细胞、成骨细胞方向分化的潜力以及细胞蛋白组学特征。为将来构建适用于临床的、有较长生命周期和有一定分化能力的骨髓间充质干细胞打下理论基础。方法和结果:使用重组病毒技术构建表达hTERT的重组逆转录病毒,用该病毒感染骨髓间充质干细胞,并使用TRAP-PCR方法证实我们重建了细胞的端粒酶活性。我们将转导了hTERT的细胞接种于免疫缺陷小鼠皮下,未见肿瘤形成。转导细胞的软琼脂细胞克隆形成实验阴性,表明转导hTERT的骨髓间充质干细胞未出现恶性转化,没有成瘤作用。另外,转导了hTERT的骨髓间充质干细胞在相应诱导液的作用下,能够向成骨细胞,软骨细胞,脂肪细胞方向分化,证实了细胞的多向分化潜能。采用双向凝胶电泳加基质辅助的激光解吸/离子化飞行时间质谱方法(2DE-MALDI-TOF-MS)分析转导hTERT与未转导hTERT的hMSCs的蛋白组学差异,我们鉴定了100种蛋白点,发现有20种蛋白质有差异表达。结论:使用表达hTERT的重组逆转录病毒感染的骨髓间充质干细胞能够再建细胞的端粒酶活性,克服细胞的复制衰老,延伸了细胞生命周期。免疫缺陷小鼠皮下接种实验和细胞克隆形成实验表明转导hTERT的骨髓间充质干细胞没有成瘤作用。在相应诱导液的作用下,转导hTERT的骨髓间充质干细胞能够向成骨细胞,软骨细胞,脂肪细胞方向分化。差异蛋白组学分析表明,在过表达端粒酶hMSCs中有11种蛋白表达明显升高,有9种蛋白表达明显下降。本文研究结果提示hTERT具有抗复制衰老、延伸细胞生命周期的生物学作用,转导了hTERT的骨髓间充质干细胞具有向多种细胞分化的潜能,在组织工程,细胞工程,和基因工程方面有很大的应用前景。我们的结果为研究hTERT基因延长细胞生命周期的分子机制提供了重要的线索。
[Abstract]:Telomerase is a nuclear protein complex composed of two components of RNA and protein , wherein the RNA component is a template used in the replication of telomerase . It is called telomerase reverse transcriptase ( hTERT ) . Its function is to use RNA template to replicate telomeric repeat fragments . It has important practical significance . Objective : To investigate the expression of hTERT gene in vitro by recombinant retroviral technology , and to establish hMSCs expressing telomerase , and to investigate whether hMSCs can extend the life cycle of hMSCs . Methods and results : The recombinant retrovirus expressing hTERT was constructed by using recombinant virus technique . The telomerase activity of human bone marrow mesenchymal stem cells was confirmed by the method of TRAP - PCR . Conclusion : The bone marrow mesenchymal stem cells transduced with hTERT have the potential to differentiate into osteoblasts , chondrocytes and fat cells . The results suggest that hTERT has the potential of resisting replication and aging and extending the life cycle of cells . The results suggest that hTERT has the potential to differentiate into various cells , and it has great potential for the tissue engineering , cell engineering and gene engineering . Our results provide important clues for the study of the molecular mechanism of hTERT gene prolonging the life cycle of cells .

【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2007
【分类号】：R329

【参考文献】