基于聚乙烯亚胺为骨架的非病毒转基因载体的研究

发布时间：2018-01-02 11:22

本文关键词：基于聚乙烯亚胺为骨架的非病毒转基因载体的研究　出处：《浙江大学》2007年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】： 基因治疗是指将人体正常基因或有治疗作用的基因通过一定方式导入人体靶细胞以纠正基因的缺陷或者发挥治疗作用，从而达到治疗疾病目的的治疗方式。运载遗传物质的工具称为载体。一项完整的基因治疗实施方案包括目的基因、转基因载体、靶细胞和实施途径的选择等四方面的内容。目前常用的转基因载体包括病毒载体和非病毒转基因载体两大类。其中病毒载体在目前的科研工作和临床试验中是主要使用的载体，占到95％以上。但是病毒载体具有一些难以克服的缺陷，如制备复杂、携带能力有限、靶向特异性差、高免疫原性、体内不能重复使用、可能导致感染的潜在危险和引起细胞恶性转化等，所以近20余年来有越来越多的研究者将视线放在了非病毒载体上面。非病毒载体包括脂质体、纳米粒、胶团等，具有成本低、制备相对简单、容易批量生产、携带遗传物质容量大、安全性好等优点，但也有转基因效率相对低下、本身并无特异细胞或组织靶向性等缺点。聚乙烯亚胺(polyethylenimine，PEI)是由酸催化氮丙啶单体聚合而形成的一种聚合物。自从约15年前发现其可以缩合质粒DNA并转运到细胞核内后，PEI作为转基因载体引起了研究人员的广泛关注。根据合成路线的不同，PEI具有线状和支链状两种结构，分子量范围在＜1000 Da到1.6×10~3 kDa之间，在转基因载体领域，以分子量为22 kDa和25 kDa的PEI应用最广。在生理pH下，游离的PEI每5-6个氨基氮中有一个氨基氮可以被质子化(约20％)，结合了核酸之后，每2-3个氨基氮中即有一个可以被质子化，进入内含体和溶酶体后，pH下降，PEI的氨基氮能够进一步发生质子化(pH为5.0时，质子化程度为45％)，大量捕获质子，并引起Cl~-离子内流，导致溶酶体渗透性肿胀，无需溶酶体溶解肽的辅助作用溶酶体即可破裂，从而将内吞的DNA释放到细胞浆而最终入核。虽然PEI作为一种转基因效率相对较高的非病毒载体，已经成为非病毒载体领域衡量其他类型载体效率的一个“金标准”，但是其本身仍具有不少缺点如相对于病毒载体转基因效率低、高分子量PEI毒性大、无法生物降解、无特异细胞或组织的靶向性以及体内应用有诸多障碍等，这些缺点明显限制了PEI的实际应用。为了克服PEI上述的不利于转基因以及体内使用的缺点，构建理想的转基因载体，需要对PEI进行改造。目前主要改造思路有配体化、聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)化等，但尚无成熟商品化产品。本研究的目的在于改造PEI，构建具有高转基因效率、低毒性、具有肿瘤细胞和组织的特异靶向性以及适合体内静脉途径使用的转基因载体。整个研究分成三部分，在以分子量为25 kDa的PEI(PEI25k)为骨架的基础上，分别通过双靶向配体肽偶联、PEG化以及以多臂PEG为核心偶联低分子量PEI三种修饰策略，设计了3类新型载体。详细研究了载体的合成过程、理化特性、缩合质粒DNA的能力、体内外毒性、体外相应细胞株中的转基因效率、特异细胞的靶向作用以及在体内荷瘤动物模型中的转基因活性，以期得到可以在肿瘤的基因治疗中发挥重要作用的理想载体并部分阐明其转基因的机制。在第一部分研究中，鉴于大部分肿瘤细胞表面高表达成纤维细胞生长因子受体(fibroblast growth factor receptors，FGFR)和整合素(integrin)，作者选择了靶向于FGFR的多肽YRSRKYTSWYVALKRTGQYKLGSKC(YC25)和靶向于整合素的含RGD肽CYGGRGDTP(CP9)两条肽，分别偶联到PEI25k上，构建了双受体靶向的载体(YC25-PEI-CP9)，观察合成的载体是否具有转基因效率提高并有特异细胞的靶向性等优点。在该部分研究中，先利用细胞免疫组织化学的方法和FITC标记的YC25肽筛选出了FGFR阳性的COS-7、HeLa细胞和FGFR阴性的PC-3细胞作为研究的工具细胞。在FTIR图谱和紫外吸收图谱上，1630cm~(-1)处的吸收峰和270 nm附近的吸收峰出现提示肽的成功偶联。通过计算~1H NMR图谱上甲基基团中质子峰、苯环中质子峰以及PEI中质子峰的积分，验证了双靶向载体中YC25和CP9与PEI25k的偶联率分别为3.6和6.4。凝胶电泳阻滞实验证明了YC25-PEI-CP9在N／P比为4的时候可以完全缩合质粒DNA。利用透射电镜发现N／P比为10的时候，YC25-PEI-CP9可以将质粒DNA缩合成粒径约为200 nm的类圆形纳米粒(polyplexes)。Polyplexes的粒径通过进一步的粒径测定验证。表面电荷测定结果表明在N／P比为10的时候，YC25-PEI-CP9和质粒DNA形成的polyplexes的表面电荷为30.9±3.6mV。在COS-7细胞中的MTT毒性实验结果表明YC25-PEI-CP9毒性略低于PEI25k。在COS-7细胞和HeLa细胞中的体外转基因实验中发现YC25-PEI-CP9在N／P比为10的时候，具有最高的效率，不仅要远高过PEI25k，也要高于单配体肽偶联的PEI25k。但在PC-3细胞中，以CP9肽单偶联的PEI25k效率最好。随后在HeLa细胞中的游离肽抑制实验证明了偶联的两条肽的靶向作用。体内荷瘤动物模型实验中，双靶向的载体也在荷HeLa肿瘤裸鼠中显示了最好的转基因效率，而在荷PC-3肿瘤裸鼠中CP9肽单偶联的PEI25k显示了良好的效率。大小鼠的急性毒性实验结果表明YC25-PEI-CP9的毒性显为PEI25k的一半左右。通过本部分的研究，作者成功构建的双受体靶向的载体YC25-PEI-CP9，其具有转基因效率高、特异肿瘤细胞和组织靶向性好等优点，但同时也有毒性大、所形成的polyplexes呈现较高表面电荷而不适合体内静脉途径使用等缺点。在第二部分研究中，为了屏蔽PEI25k表面阳性电荷，降低载体毒性，使构建的载体适合体内使用，作者利用PEI25k为骨架，以分子量3400 Da的PEG作为电荷屏蔽基团，并结合特异靶向于FGFR的肽GT10，构建了偶联率分别为1、2和4的PEG化的靶向载体PEI-PEG-GT10(1、2、4)。在本部分研究中首先用FITC标记的GT10经细胞结合实验证明了NIH3T3、HepG2细胞可以和GT10结合，而PC-3细胞则不能，并用此三种细胞作为转基因实验工具细胞使用。FTIR结果上1732 cm~(-1)处吸收峰的消失以及1658 cm~(-1)处吸收峰的出现提示合成过程的成功。通过~1H NMR结果验证了PEG以及肽相对于PEI25k的偶联率分别为1、2和4。凝胶电泳阻滞实验结果表明PEI-PEG-GT10在N／P比4～5以上时可以完全缩合质粒DNA。粒径检测表明在N／P比＞30的时候，PEI-PEG-GT10(1)可以将质粒DNA缩合成粒径为200 nm左右的纳米粒，，而且可以抵抗随着时间的延长导致的聚集现象。透射电镜观察PEI-PEG-GT10与质粒DNA在N／P比为30时形成类圆形的纳米粒，边缘结构偏疏松。其后的表面电荷测定结果表明在N／P比为30时，PEI-PEG-GT10形成的polyplexes表明电荷接近中性。体外毒性实验结果提示PEI-PEG-GT10毒性要远低于PEI25k。体外在NIH3T3细胞中的筛选实验表明PEI-PEG-GT10(1)在N／P比为30的时候，具有最高的转基因效率。在HepG2细胞中的实验验证了这一点，而在PC-3细胞中，GT10肽的偶联未能显示出更好的促转基因作用。在NIH3T3细胞中的游离肽抑制实验证明了GT10肽的靶向作用。随后的血清体系转基因实验表明PEI-PEG-GT10(1)具有抵抗血清抑制转基因的作用。在大小鼠急性毒性实验中，PEI-PEG-GT10(1)的毒性远低于PEI25k。而在荷HepG2细胞的裸鼠中，尾静脉注射PEI-PEG-GT10(1)显示了肿瘤组织的良好转基因效率，当PEI-PEG-GT10(1)携带pCSK-α-IFN质粒后，能够明显抑制肿瘤的生长。通过本部分的研究，作者成功构建了不同偶联率的PEG化的靶向于肿瘤细胞FGFR的PEI25k载体，其具有转基因效率高、能抵抗血清抑制效应、特异细胞和组织靶向性好并适合于体内应用等优点，但仍具有一定毒性。在第三部分研究中，鉴于低分子量PEI具有毒性低的特点，结合PEG所具有的屏蔽阳性电荷的作用，为了构建转基因效率高、低毒性并适合体内应用的载体，作者以8臂的PEG(8armPEG)为核心，将分子量为600Da的PEI(PEI600)串联成大分子量的聚合物(8armPEG-PEI600)，并在PEI600上偶联靶向于肿瘤细胞表面FGFR的肽MC11(8armPEG-PEI600-MC11)。通过FTIR检测1730 cm~(-1)以及1670 cm~(-1)处吸收峰的生成和消减证明了偶联的成功；通过TGA观察成功合成的8armPEG-PEI600以及8armPEG-PEI600-MC11的热分解性质发生了改变；其后通过GPC以葡聚糖为标准品验证了8armPEG-PEI600以及8armPEG-PEI600-MC11的分子量，与理论值非常接近；而~1H NMR的结果则进一步证明了8armPEG-PEI600以及8armPEG-PEI600-MC11中各组件的偶联率符合理论值。凝胶电泳阻滞实验结果表明8armPEG-PEI600和8armPEG-PEI600-MC11均在N／P比为3的时候，可以完全缩合质粒DNA，而PEI600则需要N／P比达到4方可缩合质粒DNA。通过粒径和表面电荷的检测，可以发现在N／P比为30以上时，8armPEG-PEI600和8armPEG-PEI600-MC11就可以将质粒DNA缩合成约200nm大小，表面电荷约为20mV的纳米粒。MTT的体外结果表明了8armPEG-PEI600、8armPEG-PEI600-MC11和PEI600相似，是毒性极低的聚合物。之后分别以HepG2和PC-3细胞为工具细胞，验证了合成的聚合物的转基因效率。结果表明，在两种细胞中，8armPEG-PEI600在N／P比为30的时候，均可以达到最好的效率，略低于N／P比为10时的PEI25k。但是对于8armPEG-PEI600-MC11而言，在HepG2细胞中，N／P比为30的时候，转基因效率大幅上升，是PEI25k的11倍，而在PC-3细胞中，则没有这种效率增加效应。通过肽抑制实验，可以证明在FGFR阳性的HepG2细胞中游离肽对8armPEG-PEI600-MC11的转基因具有抑制效应。体内实验结果表明polyplexes经尾静脉注射荷瘤裸鼠后，由8armPEG-PEI600所形成的polyplexes已经有很大一部分可以到达肿瘤组织，转基因效率是PEI25k的6倍。而由8armPEG-PEI600-MC11所形成的polyplexes在肿瘤组织中的转基因效率又是8armPEG-PEI600的3.1倍。如果载体携带pCSK-α-IFN治疗肿瘤，8armPEG-PEI600-MC11组显示了较好的治疗效果。通过本部分的研究，作者成功构建了载体8armPEG-PEI600-MC11，其具有转基因效率高、毒性极低、特异细胞组织靶向性好等优点，但其和质粒DNA形成的polyplexes呈现相对较高的表面电荷影响了其体内应用。综上所述，本研究通过三种偶联策略，成功地合成了FGFR和整合素双靶向的PEI25k载体、FGFR靶向的PEG化的PEI25k载体以及8armPEG为核心的串联小分子PEI600的并靶向于FGFR的载体。合成的新型载体都能够在一定的条件下将质粒DNA缩合成适合于转基因的polyplexes，且具有相应受体阳性细胞的靶向性，体外应用具有转基因效率高等特点，体内应用有一定的效果。相对于PEI25k而言，三类载体各有优点，如均有体外转基因效率高、靶向性好等特点，但亦各有缺点，如YC25-PEI-CP9毒性较大，相应形成的polyplexes的高表面电荷使其不适合静脉使用；PEG化的PEI25k仍具有一定毒性，主骨架高分子量的PEI25k无法降解；8armPEG为核心的载体形成的相应polyplexes也是呈现相对高的表面阳性电荷，影响静脉使用等。本研究横跨有机化学、分析化学、高分子化学、药物学、分子生物学和肿瘤学等多个学科领域，多学科的结合为转基因载体的开发工作提供了崭新的研究思路。研究中所选的靶向位点在肿瘤的靶向基因治疗中具有良好的应用前景。多种理化分析手段、靶向肽的设计和偶联策略等内容具有创新性。合成过程线路明确，重复性好，所需要的合成条件可行性好，为载体的大规模工业制备奠定了扎实的基础。虽然合成的载体离理想转基因载体的要求尚有一定距离，但相信通过进一步完善载体的构建策略如将PEG等分子整合入PEI主骨架、对PEI的氨基进行酰化、在PEI单体上连接疏水基团以及构建能同时携带质粒DNA和化学药物的载体等，一定能获得适合于全身应用的高效率的转基因载体并应用于具体的基因治疗方案。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2007
【分类号】：R346

【参考文献】