重组幽门螺杆菌中性粒细胞激活蛋白融合疫苗的实验研究

发布时间：2018-01-04 05:29

本文关键词：重组幽门螺杆菌中性粒细胞激活蛋白融合疫苗的实验研究　出处：《第三军医大学》2006年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】： 目的: 幽门螺杆菌(H.pylori)的全球感染率超过了50%,它是慢性活动性胃炎和消化性溃疡的主要病因,与肠型胃癌和胃黏膜相关淋巴样组织(MALT)淋巴瘤的发生密切相关。现有的根除H.pylori的手段主要是联合应用抗生素,但由于该菌感染的普遍性、耐药菌株的不断增加、较高的花费以及病人的低依从性等,限制了抗菌药物的疗效。因此,接种简便、成本低廉并易于大面积推广的H.pylori疫苗的研究十分迫切。中性粒细胞激活蛋白(HP-NAP)为新近发现的H.pylori主要毒力因子之一,几乎所有的幽门螺杆菌菌株都有表达。H.pylori尿素酶具有分布于细菌外膜、高度保守、颗粒状结构、分子量大和强免疫原性等特点,因此最早被作为H.pylori疫苗的侯选抗原。粘附于胃上皮细胞是H.pylori定植并致病的前提,阻断H.pylori的粘附显然可以防治H.pylori感染,所以,暴露于细菌表面并与H.pylori定植密切相关的粘附素HpaA是理想的候选抗原。粘膜免疫必须辅以合适的佐剂,大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)就具有很强的粘膜免疫佐剂效应。因此,本研究拟对上述三种保护性抗原基因进行克隆表达,并与分子内佐剂LTB串联得到多亚单位的融合蛋白,分别观察在小鼠体内诱导的不同免疫应答和保护作用,为筛选有效的H.pylori疫苗抗原奠定基础。方法: 1、采用PCR方法从H.pylori SS1基因组中扩增napA基因片段并构建在原核表达载体pET-11c中,通过酶切、测序鉴定阳性重组子。应用生物信息学软件DNAssist和GenBank数据库对已公布的H.pylori napA基因序列进行相似性分析。将含目的基因片段的重组载体转化大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导表达,用AKTA-explore纯化仪纯化表达的重组蛋白rNAP。应用Tris-Tricine方法对表达产物和纯化产物进行分析,用纯化的rNAP免疫家兔,并采用Western blot和免疫扩散试验鉴定重组蛋白的免疫性。 2、采用重叠延伸PCR的方法,以NAP做为融合蛋白前端,与粘膜佐剂LTB或HpaA-UreB414-LTB融合基因依次串联,在片段间引入5个氨基酸的linker PQDPP进行连接:将融合基因构建在原核表达载体pET-22b(+)中,经酶切及测序鉴定后,阳性重组子转化宿主菌E.coli BL21(DE3),IPTG诱导重组工程菌表达。Tris-Tricine电泳和免疫印迹鉴定融合蛋白,DNAssist软件分析融合蛋白理化特性,通过纯化条件摸索,AKTA-explore纯化仪纯化融合蛋白NapA-LTB(NL)和NapA-HpaA-UreB414-LTB(NHUL)。纯化后的融合蛋白分别与GM1神经节苷脂进行结合试验。 3、将重组工程菌pET28a-hu1/BL21进行IPTG诱导表达,通过包含体洗涤进行初纯化,Tris-Tricine电泳和免疫印迹鉴定融合蛋白。 4、将110只小鼠随机分为5组:PBS对照组、多亚单位分子内佐剂融合蛋白组(HpaA-UreB414-LTB、NapA-HpaA-UreB414-LTB)、单一亚单位分子内佐剂融合蛋白组(NapA-LTB)、无分子内佐剂单一亚单位蛋白组(NAP)。分别于0、7、14、28天口服免疫,剂量为150gg/只/次。末次免疫后10天,每组取10只小鼠剖杀取样,ELISA检测口服免疫后血清特异性IgG、IgA,胃、肠道粘液sIgA水平。每组余下12只口服攻毒10~8CFU H.pylori动物适应株,30天后,取小鼠胃部标本通过H.pylori培养、快速尿素酶试验及特异性PCR检测,并计算口服免疫后各组攻毒保护率。结果: 1、经酶切鉴定和基因测序结果显示,H.pylori napA基因被正确克隆到pET-11c中。NapA基因的核苷酸序列长度为432bp,与GenBank中序列比较,同源性为95%-98%,氨基酸序列的同源性为100%。重组工程菌IPTG诱导,经Tris-Tricine分析,表达的目的蛋白分子量约为17KD,其表达产物占菌体蛋白的50%,为可溶形式表达,经AKTA-explore 100蛋白纯化系统纯化,纯化后得剑纯度＞90%的目的蛋白。以纯化蛋白为抗原加弗氏佐剂免疫家兔,制备兔抗rNAP特异抗体,经免疫双扩散法检测,兔抗血清抗体效价为1∶32,Western Blot结果也显示重组蛋白能被兔抗H.pylori血清所识别。 2、经酶切鉴定和基因测序结果显示,成功构建了融合基因NapA-LTB和NapA-HpaA-UreB414-LTB,将融合基因NL和NHUL克隆到pET-22b(+)载体上,得到了重组融合蛋白表达载体。将两个阳性重组子转化至E.coli BL21(DE3)后,37℃培养经IPTG诱导,表达的融合蛋白经Tris-Tricine和免疫印迹分析显示分子量约为29KD和59KD。UVP扫描证实融合蛋白表达约占总蛋白30%和25%。融合蛋白以包涵体和可溶两种形式表达,分别采用亲和层析或离子交换层析的纯化方法,纯化后得到纯度＞80%的融合蛋白。纯化后的两个融合蛋白分别能与GM1神经节苷脂发生结合反应,实验证实重组融合蛋白中LTB组分具有与GM1神经节苷脂结合的生物活性,说明融合蛋白保持了LTB的天然活性,具有粘膜佐剂活性。 3、重组工程菌pET28a-hu1/BL21经IPTG诱导,表达的融合蛋白经Tris-Tricine和免疫印迹分析显示分子量约为42KD。融合蛋白主要以包涵体形式表达,纯化后得到纯度＞80%的融合蛋白。 4、ELISA检测融合蛋白rHUL和rNHUL免疫小鼠后血清特异性IgG、IgA,胃、肠道粘液sIgA水平与PBS、rNAP组相比,升高明显,差异极显著(p＜0.001),与rNL免疫组相比,差异显著(p＜0.05)。免疫攻毒后,免疫保护率为:rNAP组16.7%,rNL组66.7%,rHUL组83.3%,rNHUL组90.9%。统计分析显示,多亚单位融合蛋白组免疫保护率与PBS组相比,差异极显著(p＜0.001),与rNAP组相比,差异显著(p＜0.05),分子内佐剂的三价融合蛋白组rNHUL保护率最高。结论: 1、成功克隆了H.pylori napA基因,与GenBank已公布的H.pylori菌株基因序列具有高度同源性。纯化的重组蛋白rNAP,具有良好的免疫原性和免疫反应性,可以作为H.pylori基因工程疫苗候选抗原。 2、成功构建、表达融合蛋白rNL和rNHUL,纯化后的融合蛋白具有良好的抗原性;与GM1神经节苷脂结合实验证实了重组蛋白中LTB组分具有能与GM1神经节苷脂结合的生物活性。 3、诱导表达了融合蛋白rHUL,经包涵体洗涤后,Western blot检测其具有良好的抗原性。 4、小鼠体内特异性抗体水平及免疫保护效果都证明了重组融合蛋白具有良好的安全性和免疫保护效果,为进一步的疫苗研究奠定了基础。
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【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2006
【分类号】：R392

【参考文献】