人FAT10与PRAK的相互作用研究

发布时间：2018-01-04 06:39

本文关键词：人FAT10与PRAK的相互作用研究　出处：《第一军医大学》2006年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】： 丝裂原激活的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信号转导通路调节着细胞的生长、分化、分裂、对环境的应激适应、炎症反应等多种重要的细胞生理／病理过程。目前在哺乳动物细胞已发现5个MAPK亚族：细胞外信号调节蛋白激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)1和2，c-Jun氨基末端激酶(c-Jun amino-terminal kinase，JNK)1、2和3，p38α、β、γ、δ，ERK3和4，以及ERK5。MAPK的广泛生物学作用通过磷酸化各种底物如磷脂酶(phospholipase)、转录因子和细胞骨架蛋白等而实现。MAPK也可以催化并激活一些蛋白激酶，称为MAPK激活的蛋白激酶(MAPK-activated protein kinase，MK)，包括核糖体S6蛋白激酶(ribosomal S6 kinase，RSK)、丝裂原和应激激活的蛋白激酶(mitogen-and stress-activated kinase，MSK)、MAPK相互作用蛋白激酶(MAPK interacting kinase，MNK)、MK2和3、MK5。不同的MAPK亚族通过激活不同的MK介导相应的生物学功能。 p38调节激活的蛋白激酶(p38-regulated／activated protein kinase，PRAK)又称为MK5，，最初是从数据库中对MK2进行同源序列分析时发现的。由于PRAK是MK家族中相对较新的一个成员，对其激活机制及功能知之甚少。最初研究发现，PRAK的Thr~(182)能够被p38α和p38β磷酸化而激活，激活的PRAK通过磷酸化并激活热休克蛋白27(heat shock protein 27，HSP27)发挥生物学作用。然而，近来有研究认为p38在体外或体内过表达时磷酸化PRAK，但在生理状态下激活p38级联并不能显著增加PRAK活性，而PRAK也不能有效地激活HSP27。以上相互矛盾的结果表明需要进行更多的研究以明确PRAK的激活机制及其功能。为了进一步了解PRAK的相互作用蛋白及其生物学功能，我们实验室前期利用一种新的筛选技术T7噬菌体展示系统(T7 phage display system)筛选了与PRAK相结合的蛋白。经过筛选，发现FAT10可能是一个与PRAK相互作用的蛋白。 FAT10是一种泛素样修饰因子(ubiquitin like modifier, UBL)。其编码基因定位于Ⅰ型人主要组织相容性复合体(human maior histocompatibility complex classⅠ, MHCⅠ)基因座。目前关于FAT10的性质及其功能作用知之甚少，认为FAT10虽然由位于编码MHCⅠ基因座的基因编码但是可能并不参与抗原的呈递。作为一种短寿蛋白，FAT10在细胞内能够迅速被蛋白酶体降解，并且介导与其融合的蛋白降解，而这个降解过程不依赖于泛素。有关FAT10对细胞凋亡的影响尚有争议，不同实验室选择不同来源的细胞所得到的结果不一致。新近有研究发现，FAT10能够与有丝分裂停滞蛋白2(mitotic arrest deficient 2, MAD2)在有丝分裂期相互作用，从而影响细胞周期的调控，过表达的FAT10会导致染色体不稳定和多形核出现。为了有效地了解FAT10与PRAK之间相互作用介导的功能，我们首先对FAT10的性质进行了初步探讨。我们构建了带Flag标签和红色荧光蛋白(red flurourence protein, RFP)标签的FAT10表达质粒。我们将pcDNA3-Flag-FAT10转染进入HEK293细胞，用抗-Flag抗体进行Western blot检测，除了检测到一条特异性的分子量为20 kD左右的条带(单体FAT10)，还检测到一条约36kD的结合条带以及更大分子量的结合条带，提示FAT10在HEK293细胞内能够与自身或者其它蛋白形成共价复合物。另外我们发现Flag-FAT10及其36 kD结合产物在正常培养条件下随时间延长表达量递减，而给予饥饿处理后随时间延长反而增加，36 kD分子量共价结合产物与单体变化趋势一致，但是更大分子量的结合产物却是随时间延长而增加，不受饥饿处理的影响。这些结果提示正常培养情况下，FAT10及其36kD共价结合产物可能会迅速被降解。另一方面，当转染FAT10的细胞在饥饿状态下FAT10蛋白量反而增加提示可能细胞在正常状态下存在某种机制能够降解FAT10，但是当处于饥饿状态时，这种机制就遭到破坏，于是FAT10降解途径被阻断，FAT10在细胞中蓄积。我们进而采用了XTT比色法和检测基因组DNA ladder的方法比较了正常培养状态和饥饿状态下，过表达FAT10的HEK293细胞发生凋亡的情况。XTF检测结果提示，FAT10过表达的HEK293细胞在饥饿状态下存活率明显低于对照质粒转染的细胞(P＜0.05)。当细胞处于饥饿状态时，过表达FAT10的HEK293细胞会出现DNAladder现象，而正常条件培养的FAT10过表达细胞以及正常条件培养和饥饿状态下转染对照质粒的细胞则无此现象发生，这与XTT结果是一致的，提示FAT10在细胞饥饿状态下能够促进细胞凋亡，而正常培养条件下则对细胞凋亡影响不明显。另外，我们用红色荧光蛋白示踪的方法观察了外源性FAT10在HEK293细胞中的定位情况及其对各种刺激的反应。正常情况下过表达的RFP-FAT10在HEK293细胞中分布并不一致，部分细胞FAT10弥散分布在胞质胞核中；部分在胞质胞核均有表达，但是在胞核中呈现粗大明亮的颗粒；刺激剂如LPS、高渗、亚砷酸钠等对已表达的FAT10分布没有明显影响。上述结果提示FAT10的表达及亚细胞定位可能与细胞周期有关。在探讨FAT10功能特性的同时，我们进行了FAT10与PRAK相互作用的体外体内结合实验验证以及二者在HEK293细胞中的共定位研究。首先我们构建了带6个组氨酸(histidine，His)的FAT10原核表达质粒，表达纯化了His-FAT10和GST-PRAK蛋白，并进行了体外结合实验，结果表明FAT10和PRAK在体外存在特异性结合。随后我们将pcDNA3-Flag-FAT10和pcDNA3-HA-PRAK质粒共转染至NIH3T3细胞，用免疫共沉淀的方法检测了二者在真核细胞内的结合。将共表达Flag-FAT10和HA-PRAK的细胞裂解上清与M2微珠孵育后，用抗Flag抗体进行Western blot检测，发现36 kD的Flag-FAT10结合条带消失，而并没有见到代表泛素化的典型的阶梯状条带。同样处理的样品用抗HA抗体进行Western blot检测没有检测到特异性的HA-PRAK条带。共表达Flag-FAT10和HA-PRAK的细胞裂解上清与抗HA磁珠孵育后，用抗Flag抗体进行Western blot检测，没有检测到特异性的Flag-FAT10条带，用抗HA抗体进行Western blot检测，也没有检测到典型的阶梯状条带及预期的结合条带。这个结果提示二者可能存在某种相互关系，结合FAT10表达与亚细胞定位结果，FAT10和PRAK可能在细胞周期的某一期发生作用，对于这一点需要进一步探讨。同时我们对RFP-FAT10和GFP-PRAK共表达在细胞HEK293的定位进行了研究。我们发现，在给予饥饿处理24h后再加入FBS 2h后，单表达RFP-FAT10的细胞核中出现粗大明亮的红色荧光颗粒，而与GFP-PRAK共表达时胞核中的红色颗粒消失，另外，在饥饿后24h再给予FBS 1h时间点，FAT10和PRAK在胞核内有共定位。另外，饥饿后再给予FBS的2h时间点，单表达RFP-FAT10的HEK293细胞形成多形核，而共表达的细胞则无此现象发生。结合文献报道我们推测，FAT10过表达能够引起细胞染色体不稳定，出现多形核，而PRAK则能纠正这个过程。综上所述，我们发现FAT10蛋白在饥饿状态下促进HEK293细胞凋亡，并且其表达定位可能与细胞周期有关。体外结合实验表明FAT10和PRAK存在特异性结合。共定位研究表明，FAT10和PRAK在细胞周期的某一期具有空间上的共定位。细胞学实验表明，共表达FAT10和PRAK时，能被FAT10抗体识别的36 kD结合条带消失。单转染FAT10的细胞可能出现多形核，但是共转染了PRAK能纠正这种现象。我们的实验结果提示了PRAK在细胞周期调控中的新的功能，这对认识PRAK和FAT10的特性和功能具有非常重要的意义。
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【学位授予单位】：第一军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2006
【分类号】：R363

【参考文献】