毕赤酵母表达gp96-scFv抗体及生物活性测定

发布时间：2018-01-11 03:04

  本文关键词：毕赤酵母表达gp96-scFv抗体及生物活性测定　出处：《生物工程学报》2014年04期 　论文类型：期刊论文

  更多相关文章： gp-scFv抗体 毕赤酵母 gp 分泌表达 亲和力 特异性

【摘要】：旨在利用毕赤酵母分泌表达gp96-scFv抗体,纯化后得到能特异性结合gp96抗原的小分子抗体片段(scFv)。根据gp96-scFv抗体基因序列,合成gp96-scFv抗体基因序列,将gp96-scFv抗体序列克隆到毕赤酵母表达质粒pPICZα-A,线性化的重组表达载体电转化到毕赤酵母X33,甲醇诱导目的蛋白表达,通过亲和层析法纯化目的蛋白,并以SDS-PAGE和Western blotting进行鉴定。通过Western blotting、Immunofluorescence、ELISA、FACS方法对gp96-scFv抗体的生物活性进行了检测。结果成功地构建了分泌表达抗gp96蛋白scFv抗体的毕赤酵母菌,每升毕赤酵母菌培养上清经纯化可获约50 mg gp96-scFv抗体,所获抗体其分子量大约为15 kDa,具有与gp96抗原特异性结合的活性。本研究通过毕赤酵母菌成功表达了gp96-scFv抗体,生物活性Western blotting、Immunofluorescence、ELISA、FACS分析表明该抗体能特异性结合gp96。
[Abstract]:The aim of this study was to express gp96-scFv antibody by Pichia pastoris. After purification, a small molecular antibody fragment was obtained, which could specifically bind to gp96 antigen. According to the gp96-scFv antibody gene sequence, the gp96-scFv antibody gene sequence was synthesized. The gp96-scFv antibody sequence was cloned into Pichia pastoris expression plasmid pPICZ 伪 -A. the linearized recombinant expression vector was transformed into Pichia pastoris X33, and the target protein was induced by methanol. The target protein was purified by affinity chromatography and identified by SDS-PAGE and Western blotting. The protein was identified by Western blotting. Immunofluorescence,ELISA. The bioactivity of gp96-scFv antibody was detected by FACS. Results Pichia pastoris which secreted anti-#en2# protein scFv antibody was successfully constructed. About 50 mg gp96-scFv antibody was obtained for each liter of culture supernatant of Pichia pastoris, and the molecular weight of the antibody was about 15 kDa. In this study, gp96-scFv antibody and bioactivity Western blotting were successfully expressed by Pichia pastoris. FACS analysis showed that the antibody could specifically bind to gp96.
【作者单位】： 新疆农业大学农学院;中国科学院微生物研究所中国科学院病原微生物与免疫学重点实验室;中国科学院大学;
【基金】：北京自然科学基金(No.KQA201105260010A) 深圳市科技创新委员会项目(No.CYC201012290024A)资助~~
【分类号】：Q78;R392
【正文快照】： gp96是存在于真核生物细胞内质网中分子量约为96 kDa的热休克蛋白(又称GRP94)[1]。它属于HSP90家族,是胞质HSP90的旁系同源蛋白,约占细胞总蛋白的1%,在细胞各种代谢功能中都起着重要的作用[2]。gp96具有结合多肽的能力,因而在抗原加工、呈递中发挥重要作用。内源性或外源性抗

【参考文献】

相关期刊论文 前2条

1 侯鑫;刘俊娥;扈廷茂;;抑癌蛋白PTEN的原核表达、抑癌活性研究和抗体制备[J];生物工程学报;2006年01期

2 徐亚星;王赛锋;张小俊;孟颂东;;热激蛋白gp96免疫学功能及在主动免疫治疗肿瘤和传染病中的应用[J];生物工程学报;2012年03期

【共引文献】

相关期刊论文 前10条

1 韩彩芝,刘京生,许顺江,郑秀芳,魏丽君;HeLa细胞HSP-70体外诱导抗瘤免疫活性细胞的研究[J];癌症;2002年10期

2 康德智,林元相,苏东辉,何理盛,连葆强;高表达HSP70鼠脑胶质瘤细胞瘤苗的体外抗瘤作用[J];中华神经医学杂志;2003年01期

3 陈赞,杨立庄,叶伟,王伊龙;脑胶质瘤热休克蛋白抗原肽复合物抑瘤作用的研究[J];中华神经医学杂志;2003年03期

4 Min-Fu Tsan;;Heat Shock Protein and Innate Immunity[J];Cellular & Molecular Immunology;2004年04期

5 徐存拴,辛泽华,袁金云;热休克蛋白的生物学作用和转录水平调控研究进展(英文)[J];Developmental & Reproductive Biology;2002年02期

6 范云霞,黄常志;热休克蛋白70与肿瘤[J];国外医学(肿瘤学分册);2000年04期

7 吕蔡;张杰;;热休克蛋白gp96与肿瘤免疫治疗[J];国际肿瘤学杂志;2006年01期

8 范云霞;热休克蛋白与免疫应答[J];国外医学(免疫学分册);2001年02期

9 李致宏;马振刚;李晚军;刘军;韩冰;李田;潘国庆;李春峰;周泽扬;;感染家蚕微孢子虫的蚕体血淋巴蛋白质差异表达分析及质谱鉴定[J];蚕业科学;2013年05期

10 张松;邹晓平;;HSP27与消化系统肿瘤耐药相关性的研究进展[J];国际消化病杂志;2013年05期

相关会议论文 前1条

1 ;热休克蛋白70-肿瘤肽的纯化及其抗小鼠肝癌免疫效应(英文)[A];贵州省自然科学优秀学术论文集[C];2005年

相关博士学位论文 前10条

1 施桂兰;1、半相合肿瘤特异性淋巴细胞过继免疫治疗肿瘤的小鼠模型研究 2、新型溶瘤病毒oHSV2~（hGM-CSF）的构建及其抗肿瘤作用[D];北京协和医学院;2011年

2 杨隽钧;HPV治疗性重组融合蛋白疫苗的抗肿瘤作用及机制初步探讨[D];北京协和医学院;2011年

3 程书榜;热休克蛋白70与胃肠肿瘤相关性的研究[D];第二军医大学;2000年

4 王小平;热休克蛋白70复合物抗人肝癌免疫的实验研究[D];第四军医大学;2001年

5 梁增伟;HBsAg与结核杆菌HSP70融合乙型肝炎DNA疫苗的基础研究[D];重庆医科大学;2001年

6 李燕;鸡热应激蛋白108特性与功能初步研究[D];南京农业大学;2002年

7 彭明利;结核杆菌HSP70及其与HBsAg融合蛋白在Pichia pastoris 酵母中的表达和免疫学研究[D];重庆医科大学;2002年

8 兰英华;小鼠甲胎蛋白与结核分枝杆菌热休克蛋白70基因融合疫苗抗肝癌免疫研究[D];重庆医科大学;2004年

9 汤宇;混合HSPs/肽复合物疫苗免疫治疗小鼠内瘤的实验研究[D];中国人民解放军军医进修学院;2004年

10 任淑萍;BCG对HSP65-MUC1所激发的特异性抑瘤效果影响的研究[D];吉林大学;2005年

相关硕士学位论文 前10条

1 刘阳;刚地弓形虫HSP70基因重组质粒的构建及其诱导小鼠的细胞免疫应答[D];山西医科大学;2011年

2 高海霞;松江鲈（Trachidermus fasciatus）热应激蛋白及相关蛋白的cDNA克隆与原核表达[D];山东大学;2011年

3 简精;热休克蛋白90α基因多态性与肺癌危险度的关联性研究[D];华中科技大学;2009年

4 沈冲;类风湿关节炎的某些相关因素的流行病学研究[D];安徽医科大学;2001年

5 林元相;大鼠脑胶质瘤细胞HSP70表达的诱导及高表达HSP70瘤苗的体外抗瘤作用[D];福建医科大学;2002年

6 董永超;环孢素A对膀胱癌细胞系BIU-87FasL表达的调节及免疫学作用[D];第四军医大学;2002年

7 苏振兴;外阴营养不良和外阴鳞癌中热休克蛋白70的表达与HPV感染相互关系的研究[D];中国人民解放军第四军医大学;2003年

8 白晓霞;热休克蛋白70、90在人子宫内膜正常、增生过长及癌组织中的表达及意义[D];中国人民解放军第四军医大学;2003年

9 崔崇伟;人肝细胞肝癌与癌旁肝硬化组织中的HSP70的表达及其与p53在肝细胞肝癌中成复合物的初步研究[D];中国人民解放军第四军医大学;2003年

10 周生国;热休克蛋白27在大鼠肾小管间质损伤中的表达及其意义[D];南京医科大学;2003年

【二级参考文献】

相关期刊论文 前2条

1 孟颂东,高福,田波;热休克蛋白-多肽复合物在肿瘤和传染性疾病免疫中的作用[J];生物工程学报;2000年04期

2 王彦中;王赛锋;张小俊;李杨;赵世宇;孟颂东;;热休克蛋白HSP70和gp96增强乙肝DNA疫苗的细胞和体液免疫应答[J];生物工程学报;2011年05期

【相似文献】

相关期刊论文 前10条

1 曹志飞;李新平;范开;李静;梅翔;周振兴;;重组牛肠激酶轻链基因在毕赤酵母中的表达与纯化[J];生物技术通讯;2006年01期

2 张鹏;王黎霞;安健;;鸡IL-2的毕赤酵母表达和生物活性鉴定[J];中国农学通报;2010年18期

3 ;生物工程学报2006年第22卷总目次[J];生物工程学报;2006年06期

4 周利苹;张莲芬;雷楗勇;张文婷;蔡燕飞;金坚;;人血清白蛋白-C肽融合蛋白在毕赤酵母中的分泌表达[J];生物技术通报;2008年03期

5 赵菁菁,茹炳根;山蛭素(haemadin)在毕赤甲醇酵母中的表达及其性质鉴定[J];北京大学学报(自然科学版);2005年04期

6 ;《生物工程学报》2005年第21卷总目次[J];生物工程学报;2005年06期

7 黄火清;罗会颖;柏映国;王亚茹;姚斌;;来源于柠檬酸杆菌的高比活植酸酶基因在毕赤酵母中的高效表达[J];微生物学报;2006年06期

8 张仁怀,王海燕,谈宁馨,张风豪,张义正;豆豉溶栓酶基因在毕赤酵母中的表达及其产物的纯化[J];应用与环境生物学报;2005年05期

9 关波;金坚;李华钟;;改良毕赤酵母分泌表达外源蛋白能力的研究进展[J];微生物学报;2011年07期

10 李永红;饶春明;史新昌;陶磊;袁力勇;王军志;;毕赤酵母表达重组hPK-5蛋白不均一性的鉴定[J];药物生物技术;2008年03期

相关会议论文 前10条

1 蒲广西;邓刚;符启骄;周湘龙;符兆理;陈海宁;郝新保;白玉杰;梁国栋;;毕赤酵母发酵生产重组人粒细胞集落刺激因子[A];海南生物技术研究与发展研讨会论文集[C];2006年

2 王富强;周兴军;王彦芳;田雪虹;张谦;贺秉坤;;hG-CSF大肠杆菌分泌表达系统的构建[A];中国生物工程学会第三次全国会员代表大会暨学术讨论会论文摘要集[C];2001年

3 张秋伟;陈书明;;外源基因在毕赤酵母中表达的影响因素及优化策略[A];全国动物生理生化第十次学术交流会论文摘要汇编[C];2008年

4 王幸兴;仲飞;李秀锦;潘素敏;潘红丽;韩冬梅;;猪肺表面活性蛋白A基因表达载体的构建及其在HEK293细胞中的分泌表达[A];全国动物生理生化第十一次学术交流会论文摘要汇编[C];2010年

5 王革;王妍;何凌冰;乔刚;朱一松;王君艳;;酵母分泌表达重组人神经生长因子[A];山东省药学会2006年生化与生物技术药物学术研讨会论文集[C];2006年

6 史宝军;崔细鹏;陈丽芝;吕东海;周镇锋;;毕赤酵母表达的木聚糖酶的分离纯化及其性质研究[A];动物营养与饲料研究——第五届全国饲料营养学术研讨会论文集[C];2006年

7 孔宁;周余来;王毅;宿晓云;王芳;丛中一;苏曼曼;侯宜;颜炜群;;重组人抑瘤素M的表达、纯化及鉴定[A];2010施慧达杯第十届全国青年药学工作者最新科研成果交流会论文集[C];2010年

8 王波;苏丽;张玉华;魏广智;王广义;王字玲;;血小板糖蛋白GPIbavWF结合域在酵母中的表达鉴定[A];第三届全国血液免疫学学术大会论文集[C];2003年

9 张素芳;曹瑞兵;贾峗;周斌;陈溥言;;杂合抗菌肽cecA-mil的改造及在毕赤酵母中的分泌表达[A];第一届中国养猪生产和疾病控制技术大会——2005中国畜牧兽医学会学术年会论文集[C];2005年

10 余祖华;王红宁;周生;黄勇;柳萍;丁轲;;禽传染性支气管炎病毒S1基因在毕赤酵母中表达研究[A];中国畜牧兽医学会禽病学分会第十四次学术研讨会论文集[C];2008年

相关重要报纸文章 前3条

1 海文;基因疫苗临床研究新进展[N];中国医药报;2001年

2 董志昕　程守勤;我国学者从蛙类皮肤中发现新型抗氧化系统[N];中国医药报;2009年

3 记者李天舒;我科学家发现新型抗氧化系统[N];健康报;2009年

相关博士学位论文 前10条

1 陆信曜;Pseudomonas aeruginosa脂肪氧合酶的分泌表达及热稳定性改造[D];江南大学;2013年

2 孔宁;重组人OSM的制备及诱导肝癌细胞分化的实验研究[D];吉林大学;2009年

3 董自星;Lactobacillus plantarum胆盐水解酶的分泌表达和底物结合性能改造[D];江南大学;2013年

4 刘朔;纳豆激酶基因密码子优化设计与合成及在毕赤酵母中的高效表达[D];南京农业大学;2007年

5 彭明利;结核杆菌HSP70及其与HBsAg融合蛋白在Pichia pastoris 酵母中的表达和免疫学研究[D];重庆医科大学;2002年

6 方自安;分泌信号肽介导异源蛋白在酵母中分泌表达的研究及K1HAP1基因在乳酸克鲁维酵母中的功能研究[D];复旦大学;2009年

7 武兵元;大鼠α-酰胺化酶在链霉菌中的分泌表达[D];中国协和医科大学;1997年

8 张慧（Farzana Rashid）;Hepcidin 20基因克隆及在毕赤酵母中的表达[D];北京化工大学;2009年

9 汪川;可分泌高活性β-半乳糖苷酶的重组乳酸乳球菌株的构建及其产酶特性的初步研究[D];四川大学;2006年

10 王庆杰;新型毕赤酵母表面展示系统的构建及表达研究[D];山东大学;2008年

相关硕士学位论文 前10条

1 张田;利用毕赤酵母表达小C肽人胰岛素原的研究[D];上海交通大学;2008年

2 王俊;短小芽胞杆菌脂肪酶在毕赤酵母中的分泌表达[D];华中科技大学;2008年

3 魏凡华;猪白细胞介素2的巴斯德毕赤酵母表达及活性测定[D];甘肃农业大学;2006年

4 凡炼炼;人SLPI cDNA的克隆及在毕赤酵母中的表达[D];吉林大学;2006年

5 周磊磊;促血管生成素-2在毕赤酵母中的分泌表达及功能研究[D];中国人民解放军军事医学科学院;2008年

6 廖娟;禽传染性支气管炎病毒M基因在毕赤酵母中表达与蛋白活性检测[D];四川农业大学;2007年

7 李英华;鲤鱼生长激素 cDNA在毕赤酵母中的胞内表达和分泌表达[D];暨南大学;2001年

8 黄志清;猪干扰素-γ基因在毕赤酵母中的分泌表达及其抗猪瘟病毒活性的研究[D];中国农业大学;2005年

9 张晓勇;猪圆环病毒2型ORF2基因在巴斯德毕赤酵母中的表达及初步应用[D];南京农业大学;2005年

10 潘秦;重组人IL-2在毕赤酵母中的分泌表达及大规模发酵和纯化[D];吉林大学;2006年

，

本文编号：1407837