从噬菌体展示随机七、十二肽库筛选内毒素结合肽及其生物学活性研究

发布时间：2018-02-09 08:47

本文关键词： 内毒素定向进化噬菌体随机肽库多肽肿瘤坏死因子　出处：《第三军医大学》2007年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】： 研究背景和目的: 脓毒血症是临床ICU病人死亡的重要原因。据统计,在美国每年有650 750,000住院病人发展为脓毒血症,在欧洲有同样的发生率,发展中国家发生率更高。尽管医疗水平和措施不断加强,但这并没有降低脓毒血症的发病率和死亡率。脓毒血症的发病机制是侵入体内的致病微生物释放的活性成分内毒素(即LPS,lipopolysaccharide)激活单核巨噬细胞和血管内皮细胞,启动了宿主体内失控性炎症反应。如果失控的炎症因子水平持续升高,患者会经历全身炎症反应综合征、中毒性休克、多器官功能衰竭甚至死亡。 LPS(lipopolysaccharide)是引起脓毒症休克的主要致病因子。LPS可通过间接或直接两条途径激活组织细胞炎症。目前针对脓毒血症防治措施主要包括:拮抗炎症介质的生物学活性,抑制炎症介质的表达,阻断炎症反应的启动等方面。在过去的十几年中,人们尝试了多种拮抗措施控制炎症反应,包括单克隆抗体等方法,如抑制炎症介质的活性如白介素-6、肿瘤坏死因子α等,或者阻断信号通路后来减轻炎症反应,但效果甚微。近年来,人们逐渐认识到如何在早期就对炎症反应的启动实施有效的阻抑,才是控制炎症反应的最合理的途径。因此探索LPS激活失控性炎症反应中所参与的全面的分子机理,寻找中和或拮抗LPS制剂并把失控性炎症反应控制在早期环节是目前活跃的方向。其中结合噬菌体展示肽库筛选和改造肽制剂来拮抗LPS具有诱人的前景。噬菌体展示肽库技术是利用生物分子间的相互作用来筛选功能分子,它在研究蛋白质间相互作用、寻找酶和受体的激动剂和拮抗剂、研制新型诊断试剂和疫苗以及在抗肿瘤药物研究中都有重要价值。噬菌体展示肽库技术具有高库容、高效方便及灵活的筛选技术等特点,使其在许多方面占有重要地位。随着筛选靶标范围的扩展及相应的更加完善的筛选方法的建立,噬菌体展示肽库技术将会有更广泛的应用,在功能基因组学、基因疫苗研究、药物设计、寻找新配体及肿瘤导向治疗方面日益显示出强大的优势。在DNA改组、定向进化领域它也是非常有用的工具。本课题采用噬菌体展示技术,筛选与LPS结合的多肽,结合生物信息学推测与LPS相互作用分子位点,从蛋白结构数据库和文献数据库验证,体外活性实验证实。为内毒素血症的防治探索新的技术途径。主要技术方法: 制备兔抗LPS多克隆抗体供筛选过程检测用。筛选实验采用经典的亲和富集法,以LPS为靶分子,对噬菌体随机七、十二肽库进行4轮亲和筛选,获得与LPS结合的噬菌体克隆。应用结合实验和克隆斑抑制实验进一步确证。挑选出结合力强的克隆,将获得的噬菌体克隆进行DNA测序,根据噬菌体克隆基因中所插入的外源DNA序列推导出呈现的外源多肽氨基酸序列。应用DNASTAR软件及其它生物信息网络软件如BLAST软件将多肽序列比较分析,进行蛋白结构数据库和文献数据库检索。对获得的多肽采用FMOC固相合成法化学合成。通过ELISA法与PMB B (polymyxin B,)对比进行了相对亲和力测试实验。体外试验:以人单核巨噬细胞株U937细胞为模型。首先通过生长曲线法和流式细胞实验观察合成肽对细胞生长影响。活性实验中根据实验设计方案,U937细胞被分为对照组、LPS组,及P11组干预组(分为小、中、大剂量组)。进行了流式细胞检测分析(FACS)异硫氰酸荧光素标记的LPS(FITC-LPS)与U937细胞的结合。RT-PCR和检测U937细胞肿瘤坏死因子α(TNF-α)mRNA转录情况,ELISA检测细胞培养上清液测定肿瘤坏死因子α的含量。结果: 1.制备了兔抗LPS多克隆抗体,以供筛选过程检测用,为内毒素结合肽噬菌体克隆的筛选奠定了基础。 2.采用亲和筛选方法,以LPS为靶分子,经过4轮筛选,从噬菌体随机7、12肽库中获得了可与LPS结合的噬菌体克隆。 3.从获得LPS结合克隆中挑取160个噬菌体克隆,进行结合实验。根据结合实验结果挑选19(七肽库选了12个,十二肽库选了7个)个结合力最强的克隆进行DNA序列测序及生物信息学分析。十二肽库筛选到的共有核心序列为CGGAGGCGGACTCTTATGAATCCACT ,七肽库筛选到的共有核心序列为CGGAGGCGGATTCTCATGAAA,根据上述19个噬菌体克隆基因中插入的外源DNA序列推导出呈现的多肽序列,这19个噬菌体克隆融合多肽的核心序列为HWQWPHWSPPP,命名为P11肽。用筛选的肽的全氨基酸序列检索专利数据库,未发现申请保护这段氨基酸序列的专利。经BLAST检索发现有908个蛋白质与筛选的多肽有匹配位点。这些蛋白按照功能可分为七组:炎症反应形成相关,促凝血相关,细胞凋亡相关,细胞骨架重构相关,细胞能量代谢障碍相关,胞内信号转导有关,及功能未明蛋白207条。有些结果验证了一些与LPS相互作用的蛋白,如清道夫受体、巨噬细胞甘露糖受体、热休克蛋白60、白介素27受体等,也检索到一些以前不知道与LPS相互作用的蛋白分子,如层粘蛋白受体和锌指蛋白等。 4.采用FMOC固相合成法成功合成了LPS结合肽HWQWPHWSPPP-NH2,并在其C端加NH2修饰以增强其稳定性。多肽纯度超过99%,得到的多肽纯品进行质谱分析测定分子量为1453.8,与理论值1453.6相符,说明合成的多肽结构正确,纯度合乎测试要求,可用于生物学活性的检测与评价。 5.亲和ELISA检测结果显示P11与LPS有亲和力,在相同的质量浓度下,P11与LPS的亲合力比PMB低。 6 .通过生长曲线和流式细胞学分析检测结果,P11肽对U937细胞生长无显著影响。利用新鲜人外周血分离单核细胞、U937细胞,通过流式细胞仪观察到P11具有阻止FITC-LPS体外结合作用。 7.细胞因子生成抑制实验发现,高浓度P11(10μg/ml)可显著抑制LPS诱导U937细胞TNFαmRNA转录和蛋白的表达。结论: 1.本研究成功的从噬菌体随机7、12肽库中筛选获得了可与LPS结合的噬菌体克隆。 2.筛选获得与LPS结合的噬菌体克隆展示肽的核心序列为HWQWPHWSPPP。检索可发现与体内相关蛋白质同源匹配位点。 3.应用FMOC固相法成功合成11肽HWQWPHWSPPP-NH2,命名为P11,结果证明P11对U937细胞生长无显著影响,具有抑制LPS诱导U937分泌TNFα的活性。上述研究结果说明从肽库中筛选内毒素结合肽是可行的。以这些多肽为先导物设计开发或者进一步开展定向进化研究来开发靶向LPS的抗炎多肽是可能的。这为探索内毒素血症的防治提供了新的途径。
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【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2007
【分类号】：R392

【参考文献】