褪黑素对人骨髓间充质干细胞的作用研究及其机制初步探讨

发布时间：2018-02-09 11:07

  本文关键词： 骨髓间充质干细胞 增殖 分化 褪黑素 褪黑素受体　出处：《山西医科大学》2007年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】： 目的:探讨褪黑素(melatonin,Mel)对人骨髓间充质干细胞(mesenchymal stemcells,MSCs)增殖分化的作用,以期优化MSCs扩增及向神经元样细分化的实验参数;研究Mel干预的MSCs上Mel受体亚型mRNA的表达情况,为进一步研究和临床应用奠定基础。 方法:1.以密度梯度离心结合贴壁培养方法分离MSCs,以含15%胎牛血清L-DMEM培养基进行培养,用流式细胞仪检测CD45、CD44、CD105。2.取传至6代的MSCs,加入不同浓度的Mel,MTT法分别检测24小时、3天、5天细胞的增殖情况;免疫细胞化学法和RT—PCR法检测Mel诱导后24h、3天、5天MSCs表面NSE、GFAP的表达。3.RT—PCR法测定Mel诱导的第6代MSCs上,Mel受体MT_1和MT_2mRNA的表达情况:提总RNA,逆转录,PCR扩增,凝胶电泳,体外基因测序。 结果:1.MSCs接种后贴壁良好,折光性强,3天后可见梭状或多边形细胞呈集落状生长,传代迅速,至第5～6代时呈现较均一的成纤维细胞样形态。流式细胞法检测结果为:CD44~-、CD105~+、CD45~-,证明为较纯的MSCs。2.加入Mel后,实验组MSCs增殖情况和对照组比较,差异不显著。加入Mel后24小时镜下观察见MSCs形态发生变化,宽大扁平的细胞体向胞核收缩,出现双极及多极细胞,有细长突起,3天后变形细胞增多,细长突起相互连接、交织。持续至5天后变形细胞达到高峰。免疫细胞化学法测得诱导后24h、3d、5d Mel高浓度组和低浓度组的NSE染色阳性率较对照组差异显著;各组GFAP染色均呈阴性。3.RT—PeR:提MSCs总RNA,行RT-PeR,琼脂糖凝胶电泳出现一阳性条带,分子量约为370bp,与MT_1引物核苷酸数目(368bp)相符合,320bp附近未出现阳性条带。测序结果示,扩增获得的基因序列与Genbank中人MT_1受体亚型的基因序列相吻合。 结论:1.本实验采用密度梯度离心法结合贴壁纯化MSCs,建立了稳定的MSCs培养增值体系,细胞成活率高,贴壁良好,可连续传15代。该采集方法简便易行,体外扩增容易,细胞获得丰富,可推荐为MSCs研究的常规培养方法。2.在Mel诱导下,MSCs可分化为神经元样细胞;Mel对MSCs的增殖无明显作用。3.本实验用RT-PCR技术,初步证实被Mel诱导的MSCs存在MT_1受体mRNA的表达;通过测序,扩增所获得的基因序列与GenBank的人MT_1受体亚型的基因序列相一致,提示Mel干预的MSCs存在MT_1受体mRNA的表达。本实验未检测到亚型MW_2 mRNA的表达,可能因为Mel干预的MSCs不存在MT_2mRNA的表达。
[Abstract]:Objective: to investigate the effect of melatonin on the proliferation and differentiation of mesenchymal stem cells (MSCs) of human bone marrow mesenchymal stem cells (MSCs) in order to optimize the experimental parameters of MSCs amplification and neuron-like fine differentiation, and to study the expression of Mel receptor subtype mRNA on MSCs induced by Mel. To lay a foundation for further research and clinical application. Methods 1. MSCs were separated by density gradient centrifugation combined with adherent culture, and cultured on L-DMEM medium containing 15% fetal bovine serum. Flow cytometry (FCM) was used to detect CD45, CD44and CD105.2. The proliferation of cells was detected by different concentrations of Melton-MTT assay after 6 passages of MSCs were added to detect the proliferation of cells in 24 hours and 3 days and 5 days respectively. Immunocytochemistry and RT-PCR methods were used to detect the expression of MSCs on MSCs surface at 3 and 5 days after Mel induction. 3. RT-PCR was used to detect the expression of Mel receptor MT_1 and MT_2mRNA on the sixth generation MSCs induced by Mel: total RNAs, RT-PCR amplification, gel electrophoresis and gene sequencing in vitro. Results\\\%\\%\\\%\%\%\%\%\%. The results of flow cytometry were as follows: 1. The results of flow cytometry were as follows: 1. The results of flow cytometry showed that it was a pure MSCs.2.After the addition of Mel, the proliferation of MSCs in the experimental group was compared with that in the control group. The morphologic changes of MSCs were observed under microscope 24 hours after the addition of Mel. The large, flat cell bodies contracted to the nucleus, bipolar and multipolar cells appeared. After 3 days, the number of deformable cells increased and the slender processes were connected with each other. The positive rates of NSE staining in high concentration and low concentration Mel groups were significantly higher than those in control group 24 h after induction at 3 d and 5 d after induction by immunocytochemistry. GFAP staining was negative in all groups. RT-PeR: total MSCs RNA was extracted. A positive band was detected by RT-PeR and agarose gel electrophoresis with a molecular weight of about 370 BP, which coincided with the number of MT_1 primer nucleotides and there were no positive bands in the vicinity of 320bp. The amplified gene sequence coincided with the gene sequence of human MT_1 receptor subtype in Genbank. Conclusion 1. In this experiment, a stable culture system of MSCs was established by density gradient centrifugation combined with adherent purification. The cell survival rate was high, the adherent was good, and the cells could be transmitted for 15 consecutive generations. The method was simple and easy to amplify in vitro. The cells were abundant and could be recommended as a conventional culture method for the study of MSCs. (2) MSCs could differentiate into neuron-like cells. Mel had no obvious effect on the proliferation of MSCs. 3. RT-PCR technique was used in this experiment. The expression of MT_1 receptor mRNA in MSCs induced by Mel was preliminarily confirmed, and the sequence obtained by sequencing was consistent with that of human MT_1 receptor subtype of GenBank. The results suggested that MT_1 receptor mRNA was expressed in MSCs treated with Mel, but no expression of MW_2 mRNA was detected in this study, which may be due to the absence of MT_2mRNA expression in Mel induced MSCs.
【学位授予单位】：山西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2007
【分类号】：R329

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