病毒载体介导B7-H1延长同种异体小鼠皮肤移植物存活的实验研究

发布时间：2018-02-10 16:30

本文关键词： B7-H1 共刺激分子慢病毒腺病毒皮肤移植免疫耐受排斥反应　出处：《第三军医大学》2007年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】： 诱导宿主对供体特异性的免疫耐受,可以从根本上解决临床器官移植中的免疫排斥问题。虽然应用免疫抑制剂可以有效地抑制宿主免疫系统对移植物的排斥反应,但长期大剂量地使用免疫抑制剂具有明显副作用,因为它在抑制免疫排斥反应的同时,极大地削弱了患者的免疫防御功能,增加了患者发生肿瘤和机会性严重感染的概率。尽管人们从多方面改进了诱导免疫耐受的策略,并在一些动物试验中取得了成功,但真正具有临床应用价值的可行方案并不多。通过共刺激分子抑制T细胞的活化和增殖来诱导免疫耐受是近年来移植免疫的研究热点。 B7-H1能够提供T细胞活化的负性共刺激信号,广泛表达于淋巴组织和非淋巴组织,是影响效应性和记忆性T细胞功能的重要共刺激分子。其受体PD-1(programmed death 1)与CTLA-4结构相似,是CD28家族的第4个成员,胞外区氨基酸序列上与CTLA-4分子的有24%同源性,主要以单体形式表达于活化的CD4+T和CD8+T细胞及B细胞表面。体外细胞实验发现:B7-H1结合PD-1后,能抑制已经活化的T细胞增殖及分泌细胞因子,特别是能够显著抑制效应性CD8+T细胞的活化。在T细胞受到抗原刺激时,B7-H1/PD-1信号通路能拮抗正性的B7-CD28共刺激信号,提示B7-H1/PD-1信号通路对T细胞应答具有负性调节作用。B7-H1在非淋巴组织的表达,提示它们可以下调自身反应性T、B细胞在外周组织中的应答,可能参与自身耐受的形成。研究证实,增强B7-H1的表达可以下调已活化的T、B细胞在外周组织中的应答,在维持外周T、B细胞耐受中发挥重要的作用。本研究构建了表达小鼠B7-H1基因的慢病毒载体,试图通过B7-H1基因的表达在不同的小鼠品系间诱导同种异体皮肤移植耐受。为了探讨B7-H1在诱导皮肤移植耐受中的作用及其生物学功能,我们完成了如下四部分工作: 1.构建表达小鼠B7-H1基因的慢病毒穿梭载体plenti6/V5-D-TOPO/mB7-H1重组子:用RT-PCR方法从C57BL/6小鼠肝脏组织中克隆获得B7-H1 cDNA全长ORF,并定向克隆到plenti6/V5-D-TOPO载体,经测序证实无突变。 2.表达小鼠B7-H1基因的慢病毒的包装:在293FT包装细胞完成了表达B7-H1基因的慢病毒包装。测定B7-H1重组慢病毒和空病毒的滴度分别为3.4×108TU/ml和8.5×108TU/ml。病毒感染B16F10细胞后,免疫组织化学法证实B16F10细胞表面有B7-H1和V5蛋白的表达。流式细胞术检测慢病毒感染B16F10细胞后B7-H1融合蛋白的阳性率为36%。 3. B7-H1重组腺病毒的制备和鉴定。B7-H1重组腺病毒为段文元博士制备成功,鉴定正确的重组腺病毒大量扩增,通过GFP荧光计数法测定B7-H1重组腺病毒和对照空病毒的滴度分别为1×1012 TU /ml和3×1012 TU /ml。 4. B7-H1在延长同种异体皮肤移植存活时间中的作用:以C57BL/6小鼠为供皮鼠,BALB/c小鼠为受皮鼠行同种异体皮肤移植。将70只BALB/c小鼠随机分为:正常对照组(A组)、环孢霉素A (CsA)处理组(B组)、B7-H1重组慢病毒处理组(C组,LV/B7-H1)、慢病毒空病毒载体处理组(D组,LV/B7-H0)、B7-H1重组腺病毒处理组(E组,AD/B7-H1),腺病毒空病毒载体处理组(F组,AD/B7-H0),B7-H1重组慢病毒和B7-H1重组腺病毒共处理组(G组,LV/B7-H0+AD/B7-H1),每组10只。统计学分析结果显示,从A组到G组移植皮片平均存活时间(Mean survival time,MST)分别为:10.80士1.87;14.80士3.43;20.5士4.30;11.1士2.42;15.6士2.32;10.7士2.06和16.1士2.73天。A、D、F皮肤移植物的MST无显著性差异(P0.05),说明单纯使用慢病毒、腺病毒载体对移植皮片的存活无明显影响;而B、C、E、G组MST与A组比较均明显延长,有显著性差异(P0.01),说明病毒载体介导B7H1同免疫抑制剂CsA一样可以抑制同种异体皮肤移植排斥反应;C、E、G组与B组比较移植皮片平均存活时间有显著性差异(P0.05),说明B7-H1基因转染供体移植物后抑制排斥反应的作用比CsA更为显著;C组MST较E、G组显著延长(P0.01),而E、G组MST差异不明显(P0.05),显示B7-H1慢病毒抑制同种异体皮肤移植排斥反应的能力较B7-H1腺病毒为高,但慢病毒和腺病毒共转染并无相加作用。
[Abstract]:the immune tolerance of the host immune system to the graft can be fundamentally solved due to the immune tolerance of the host immune system to the donor . B7 - H1 ( programmed death 1 ) is similar to the structure of T cells . It is the fourth member of the CD28 family . The B7 - H1 / PD - 1 signal pathway can inhibit the activation of activated T cells and secrete cytokines , especially the activation of CD8 + T cells . In order to investigate the role of B7 - H1 in inducing skin graft tolerance and its biological function , we completed the following four parts : 1 . Construction of a mouse B7 - H1 gene was constructed by using RT - PCR to clone the full - length ORF of B7 - H1 cDNA from the liver tissues of C57BL / 6 mice . 2 . The expression of B7 - H1 gene was expressed in 293FT packaging cells . The titer of B7 - H1 recombinant lentivirus and air virus was 3.4 脳 108 TU / ml and 8.5 脳 108 TU / ml , respectively . After virus infection of B16F10 cells , the expression of B7 - H1 and V5 protein was confirmed by immunohistochemical method . The positive rate of B7 - H1 fusion protein was 36 % . 3 . Preparation and identification of B7 - H1 recombinant adenovirus . B7 - H1 recombinant adenovirus was successfully used to identify the correct recombinant adenovirus . The titer of B7 - H1 recombinant adenovirus and control air virus was 1 脳 1012 TU / ml and 3 脳 1012 TU / ml respectively by GFP fluorescence counting method . 7 BALB / c mice were randomly divided into two groups : normal control group ( group A ) , cyclosporine A ( CsA ) treatment group ( group B ) , B7 - H1 recombinant lentivirus treatment group ( group D , LV / B7 - H1 ) , adenovirus empty virus vector treatment group ( group E , AD / B7 - H1 ) , adenovirus empty vector treatment group ( group F , AD / B7 - H ) , B7 - H1 recombinant lentivirus and B7 - H1 recombinant adenovirus co - treatment group ( group G , LV / B7 - ho + AD / B7 - H1 ) . The mean survival time ( MST ) was 10.80 + 1.87 , 14.80 + 3.43 , 20.5 + 4.30 , 11.1 + 2.42 , 15.6 + 2.32 , 10.7 + 2.06 and 16.1 + 2.73 days .

【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2007
【分类号】：R392

【参考文献】