HMGN2抗菌机制及其趋化活性研究

发布时间：2018-02-10 14:51

本文关键词： HMGN2 分离纯化抗菌机制膜通透性 DNA结合生物被膜中性粒细胞趋化　出处：《四川大学》2007年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】： 本室首次报道核因子高迁移率组蛋白N2(High Mobility GroupChromosal protein N2，HMGN2)具有抗菌的新功能，本文旨在对HMGN2分子抗菌机制和是否具有趋化活性进行研究，分为三个部分。第一部分：组织源性和重组的HMGN2分离纯化及鉴定。【目的】制备组织细胞和重组质粒来源的HMGN2分子。【方法】用5％高氯酸萃取人或动物组织或细胞，萃取物通过反相高效液相色谱进一步分离纯化，收集目的分子。IPTG诱导HMGN2重组表达质粒pET-32a-c(+)-HMGN2，亲合层析及高效色谱分离，收集相应洗脱峰。用SDS-PAGE和Western blot方法鉴定分离纯化的组织源性和重组的HMGN2分子；并用琼脂糖凝胶弥散法对其抗菌活性鉴定。【结果】SDS-PAGE显示从组织细胞和重组表达质粒中都制备得到了分子量约18KD的目标分子，通过Western blot鉴定可见强阳性信号；而琼脂糖凝胶弥散法显示组织源和重组HMGN2分子都具有抗大肠埃希菌作用，二者抗大肠埃希菌效能与人中性粒细胞防御素(HNP)相当，对革兰阳性菌无抗菌活性。【结论】从组织细胞和重组质粒制备了高纯度并具抗大肠埃希菌活性的HMGN2分子，，为后续研究其抗菌机制和生物学功能打下了基础。第二部分：HMGN2分子抗大肠埃希菌机制研究。【目的】探讨HMGN2抗大肠埃希菌的机制。【方法】采用细菌膜通透性实验，DNA凝胶阻滞实验，用平板培养法制备细菌早期和成熟生物被膜，银染及电镜观察HMGN2对被膜形成干扰，及已形成生物被膜破坏。【结果】HMGN2与大肠埃希菌共孵育，孵育上清OD_(280)、OD_(260)增大，与阴性组具有显著性差异。同时HMGN2分子与大肠埃希菌K12质粒DNA和染色体DNA呈浓度依赖性结合，阻滞了DNA在琼脂糖胶中电泳迁移。银染结果显示：HMGN2与细菌共培养，滤膜透光性较强，未见黑染，而当被膜形成后，用HMGN2分子处理，其早期和成熟被膜呈不同程度的黑染消褪，透光性增强。HMGN2与细菌共培养，电镜观察显示滤膜上不能形成生物被膜；细菌形成生物被膜后，HMGN2可使覆盖于滤膜上的早期和成熟生物被膜破坏，仅见零星细菌附着。【结论】HMGN2至少可通过两种方式即影响细菌膜通透性和干扰细菌DNA转录过程，发挥其抗大肠埃希菌的功能；生物被膜实验提示HMGN2分子可通过阻生物被膜形成及破坏已形成的生物被膜，影响大肠埃希菌的黏附定植和细菌的生长繁殖，增强对大肠埃希菌的清除能力。第三部分：探讨HMGN2分子是否对中性粒细胞具有活化和趋化作用。【目的】研究HMGN2分子是否可以活化中性粒细胞及是否具有趋化中性粒细胞的活性。【方法】用密度梯度离心法和糖原诱导法分别从人外周血和豚鼠腹腔渗出液中分离中性粒细胞。用硝基四氮唑蓝还原实验检测HMGN2对中性粒细胞的活化效应。采用Transwell趋化法和琼脂糖胶下实验观察HMGN2分子对中性粒细胞是否具有趋化效能。【结果】还原实验显示HMGN2组阳性细胞为20％左右，统计学分析显示其与生理盐水组无显著差异，而LPS组活化细胞为65％左右，与生理盐水组比较有显著性差异；Transwell小池趋化，倒置相差显微镜观察，HMGN2组迁移细胞平均数为47左右，与阴性对照组迁移细胞数相当，无显著差异，而干酪素阳性组迁移细胞平均数为200左右；琼脂糖胶下实验光镜观察，LPS组迁移指数为3．64±0．53，阴性对照迁移指数分别为0．13±0．25，HMGN2组为0．17±0．23，与其无显著性差异。【结论】HMGN2分子对中性粒细胞没有活化和趋化作用。
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【学位授予单位】：四川大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2007
【分类号】：R392

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