N-甲基-D-天门冬氨酸受体2B亚基表位DNA疫苗的构建及其镇痛效应的研究

发布时间：2018-02-20 15:29

本文关键词： N-甲基-D-天门冬氨酸受体 2B亚基表位疫苗基因自身抗体神经病理性痛慢性痛觉过敏痛觉异常镇痛　出处：《华中科技大学》2007年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】： 研究背景与目的疼痛可使机体对外界伤害性刺激产生防御性反应,然而,病理性疼痛的治疗却一直是困扰医学的难题,尤其是神经病理性疼痛,其发病机制复杂、治疗困难。阿片类药物是目前治疗神经病理痛最常用的镇痛药物,但长期用药会产生阿片耐受与依赖,导致镇痛失败。有关疼痛调控的受体机制是当今神经学科研究领域的热点,研究表明存在于神经元和神经胶质细胞膜上的N-甲基-D-天门冬氨酸受体(N-methyl-D-aspartate receptors, NMDAR)过度激活能够产生和释放致痛活性物质,在慢性顽固性疼痛的形成、维持过程中起着重要作用[1],本研究室的近期工作亦证实了这一点[2,3]。进一步研究表明,NR2B亚基在疼痛的产生和中枢痛觉过敏的形成中发挥着主导作用[4],特异性抑制或阻断NR2B功能的病理性上调可以达到良好的疼痛治疗效果,被认为是很有希望的新型镇痛方法。但目前已有的NR2B受体拮抗剂或阻断剂如CP101606,Ro256981等,由于其心脏毒性至今不能用于临床[5],对此类特异性药物继续研制将难以突破技术条件的限制,或将陷入“空间窗”过大或“时间窗”过小的境地,新策略的研究迫在眉睫。基因免疫(gene immunization)又称DNA免疫或核酸免疫,是将编码某种抗原蛋白的外源基因与质粒重组后,利用某种方法直接导入动物细胞内,使带有目的基因的表达载体转化到体内,通过宿主细胞的转录合成抗原蛋白,经内源性表达并提呈给免疫系统,诱发机体产生针对目的抗原蛋白特异性的体液免疫和细胞免疫,形成对相应病原的免疫保护作用,用于免疫注射的质粒DNA称为核酸疫苗(nucleicaci dvaccine)、基因疫苗(genetic vaccine)或DNA疫苗。现代疫苗技术的发展不仅能够针对外源性抗原,而且能针对机体自身抗原制备特异性疫苗。表位(epitope)是抗原分子中决定抗原特异性的特殊化学基团,又称抗原决定簇(antigenic determinant),它是TCR/BCR及抗体特异结合的基本单位。表位疫苗(epitope vaccine)是用抗原表位氨基酸序列制备的疫苗,包括合成肽疫苗(synthetic peptide vaccine)、重组表位疫苗(recombinant epitope-based vaccine)及表位核酸疫苗(epitope DNA vaccine,minigenes/epigenes),是目前研制感染性疾病和恶性肿瘤疫苗的方向。鉴定表位常用的方法有:(1)酶解法;(2)用噬菌体显示肽库技术筛选模拟表位;(3)洗脱法:将表位从MHC分子或单抗上洗脱下来,进行测序;(4)合成重叠肽法;(5)用计算机软件分析整个基因组,将预测获得的候选表位肽再用实验方法验证,能够快速准确的鉴定出抗原表位。本研究拟通过噬菌体肽库展示技术筛选NR2B模拟抗原表位,采用基因工程技术构建NR2B表位DNA疫苗,诱导机体产生特异性抗体,利用该抗体与中枢神经系统NR2B高度特异性结合,成为新型的NR2B特异性“生物拮抗剂”,下调或阻断NR2B的激活,从而观察NR2B表位DNA疫苗的镇痛效应。旨在建立安全(无致病性)、可靠的镇痛疫苗库,为此技术应用于临床奠定基础。研究方法与结果 1. N-甲基-D-天门冬氨酸受体2B亚基表位的筛选方法:以NR2B单克隆抗体为配基,免疫亲和筛选以融合蛋白形式表达在丝状噬菌体M13外壳蛋白Ⅲ上的随机十二肽。经过3轮筛选,从第3轮洗脱物中随机挑选12个噬菌体克隆扩增后进行ELISA鉴定,用酶标仪测定波长450nm处的吸光值。对这12个克隆分别进行扩增、纯化,并提取每个克隆的DNA测序以确定插入十二肽的氨基酸序列。通过细胞竞争ELISA法分析阳性克隆对NR2B天然抗原表位与其单克隆抗体结合的竞争性抑制。结果:经过3轮筛选后能与NR2B单抗特异性结合的噬菌体得到了有效富积。ELISA结果显示12个克隆中有9个克隆的A450值显著高于其它3个克隆。DNA测序结果分析表明这9个克隆表达了一个共同序列:5′- TCG CAT CCG CCT GTG ATG CCT TGG CCT ACT TCG ACT-3′,根据遗传密码翻译得到氨基酸序列为:SHPPVMPWPTST,将其命名为阳性克隆。细胞竞争性ELISA显示该阳性克隆可以竞争性抑制细胞表面天然抗原与特异性抗体的结合,抑制率(45.2±3.4)%,具有抗原模拟性。 2. N-甲基-D-天门冬氨酸受体2B亚基表位DNA疫苗的构建及制备方法:根据实验1所得到的NR2B表位DNA序列,设计合成两条部分互补的DNA单链,用PCR法合成NR2B表位基因片段。将该NR2B表位编码基因克隆入真核高效表达载体pDC515中,构建pDC515/eNR2B重组质粒,经EcoRⅠ和SalⅠ双酶切和DNA测序鉴定其正确性。将其在大肠杆菌DH5α中扩增,进行质粒大量抽提,DNA纯化,得到浓度为600μg/ml的NR2B表位DNA疫苗(pDC515/eNR2B)。在293fectinTM介导下将pDC515/eNR2B体外转染293细胞后,经RT-PCR及免疫细胞化学染色法鉴定目的基因的表达。结果:通过基因重组后正确构建了pDC515/eNR2B重组质粒,经琼脂糖凝胶电泳鉴定该片断大小约80bp,DNA测序证实其序列正确性。经过扩增、纯化后得到了高纯度、高浓度的NR2B表位DNA疫苗。以其转染293细胞后,在转染的293细胞中用RT-PCR可检测到NR2B的mRNA,用免疫细胞化学染色法检测其胞质染色呈阳性。 3. N-甲基-D-天门冬氨酸受体2B亚基表位DNA疫苗免疫学特性的鉴定方法:40只SD大鼠随机分为4组:pDC515/nr 2B组,pDC515组,PBS组及未处理组,每组10只。除未处理组外,其余3组分别用100μg的pDC515/nr 2B、pDC515或100μl的PBS于0 d及7 d各肌注1次进行免疫。于免疫前、二次免疫后8d、14d、21d时,采集大鼠血液分离血清,ELISA法检测血清中抗NR2B抗体的水平。免疫组织化学法和Western-blot法检测免疫血清中NR2B抗体与自身腰段脊髓组织中NR2B受体的特异性结合。MTT法检测NR2B表位DNA疫苗免疫大鼠血清对PC12细胞增殖率的影响。流式细胞法分析免疫血清对谷氨酸损伤PC12细胞胞内游离钙离子浓度的影响。结果:采用肌肉注射法将100μg的NR2B表位DNA疫苗间隔1周免疫大鼠,免疫后8d时大鼠血清中可检测到特异性NR2B抗体,高滴度持续至免疫后至少21d。pDC515组、PBS组及未处理组均未检测到相应NR2B抗体。免疫组织化学法和Western-blot法检测到NR2B表位DNA疫苗免疫血清中的NR2B抗体可与自身脊髓组织中的NR2B结合,具有自身抗体的特性。MTT法检测到NR2B表位DNA疫苗免疫大鼠血清对PC12细胞增殖率的影响,与pDC515组、PBS组及未处理组血清比较差异无统计学意义,表明免疫血清中的特异性NR2B抗体对PC12细胞的生长特性无影响。流式细胞法分析显示NR2B表位DNA疫苗免疫大鼠血清可使谷氨酸损伤PC12细胞胞内钙离子水平降低,与pDC515组、PBS组及未处理组血清比较,P0.05。 4. N-甲基-D-天门冬氨酸受体2B亚基表位DNA疫苗镇痛效应的研究方法:80只雄性SD大鼠随机分为5组:未处理(Naive)组(n=7)、SNI组(n=42)、假手术(Sham)组(n=7)、SNI+pDC515/eNR2B组(n=12)及SNI+pDC515组(n=12),除Naive组外,SNI组、SNI+pDC515/eNR2B组及SNI+pDC515组3组均实行保留性神经损伤术(spared nerve injury, SNI)建立慢性神经病理性疼痛模型,Sham组只对胫神经和腓总神经进行游离而不离断,其余操作同SNI组。其中SNI+pDC515/eNR2B组、SNI+pDC515组分别用100μg的pDC515/eNR2B、pDC515于SNI术后5 d及12d各肌注1次进行免疫。SNI组(n=42)再随机分为4个亚组:SNI组(n=8),SNI+Ifen组(n=12),SNI+Morph组(n=12),SNI+mAbNR2B组(n=10)。剔除SNI术后模型不理想或免疫后体重明显下降(≥50g)的大鼠,共3只(pDC515/eNR2B组2只,pDC515组1只)。其中SNI+Ifen组和SNI+mAbNR2B组于SNI术后21d、26d分别腹腔注射10mg/kg的选择性NR2B拮抗剂Ifenprodil或10mg/kg的NR2B单克隆抗体(mAbNR2B);SNI+Morph组于术后20 d开始,每次行为学测试前15min腹腔注射10mg/kg的吗啡。于SNI术后-1d、5d、12d、20d、25d、30d、37d用Von Frey丝法测量各组大鼠术侧后肢机械缩爪阈值( mechanical withdrawal threshold,MWT),以鉴定NR2B表位DNA疫苗(pDC515/eNR2B)的镇痛效应,并与mAbNR2B、Ifenprodil、吗啡的镇痛效果进行比较。 ELISA法检测Naive组、SNI组(n=8)、Sham组、SNI+pDC515/eNR2B组及SNI+pDC515组SNI术后-1d、5d、12d、20d、25d、30d、37d时血清中抗NR2B抗体的水平。SNI术后37d时处死大鼠,免疫组织化学染色法计数各组脊髓背角NR2B阳性细胞数;免疫组织化学染色法观察Naive组、SNI组、Sham组、SNI+pDC515/eNR2B组、SNI+pDC515组、SNI+mAbNR2B组、SNI+Ifen组脊髓背角星形胶质细胞、小胶质细胞及IL-1β表达的改变;Western-blot法检测各组大鼠脊髓组织中NR2B的含量。流式细胞法检测NR2B表位DNA疫苗(pDC515/eNR2B)免疫血清、mAbNR2B、Ifenprodil及吗啡对谷氨酸损伤PC12细胞胞内游离钙离子水平的影响。结果:SNI术后5d大鼠术侧后爪即出现痛觉异常现象,与Na?ve组相比,Sham组缩爪阈值的变化无统计学意义(P0.05);其余6组的缩爪阈值明显降低(均P0.01),并且SNI组、SNI+pDC515组两组的缩爪阈值持续降低至处死前,在术后各时点与Na?ve组比较均有显著差异(P0.01),表明空质粒免疫对慢性痛大鼠的痛敏无改善。SNI术后12d(即初次免疫后7d但尚未进行二次免疫)时,SNI+pDC515/eNR2B组的缩爪阈值与SNI组相比已明显升高(P0.05),并持续至SNI术后25d、30d、37d,但SNI+pDC515/eNR2B组的缩爪阈值与各时点SNI+Morph组比较仍存在显著差异(P0.05),而与SNI+mAbNR2B组及SNI+Ifen组比较差异无统计学意义(P0.05),表明NR2B表位疫苗的镇痛效果较吗啡差,但与腹腔直接给与mAbNR2B及Ifenprodil的效果相似。同时结果还表明,在SNI术后37d时,SNI+mAbNR2B组及SNI+Ifen组的缩爪阈值与SNI术后30d时比较又呈下降趋势,说明腹腔直接给与mAbNR2B及Ifenprodil的镇痛效果持续时间较短,停药后10d左右其作用减弱,而NR2B表位疫苗的镇痛作用可长时间维持至免疫后3周多。 ELISA法检测表明肌肉注射NR2B表位DNA疫苗后8天即可有效诱导机体产生高水平的特异性抗体,并至少持续至免疫后3周。 SNI术后37d(即免疫后25d)时,与Na?ve组相比,SNI组的NR2B阳性细胞数明显增加(P0.05); SNI+pDC515/eNR2B组和SNI+mAbNR2B组的NR2B阳性细胞计数明显低于SNI组(P0.05);而SNI+pDC515组、SNI+Ifen组的NR2B阳性细胞计数与SNI组比较无统计学意义(P0.05);但SNI+Morph组与SNI组相比差异无统计学意义(P0.05)。表明pDC515/eNR2B免疫及腹腔直接给与mAbNR2B均可下调被慢性神经病理痛激活的NR2B蛋白,而不携带NR2B表位的空质粒免疫未能下调激活的NR2B;Ifenprodil作为NR2B的选择性拮抗剂,虽然同pDC515/eNR2B免疫及腹腔直接给与mAbNR2B一样可以使慢性神经病理痛大鼠的痛阈有所改善,但本研究中未观察到其对NR2B蛋白表达的影响。吗啡虽然显著逆转了慢性神经病理痛大鼠的痛阈,但其对NR2B蛋白的激活却未见改善。Western-blot法检测各组大鼠脊髓NR2B含量变化的结果同免疫细胞化学染色法检测结果。免疫后25d时,与Na?ve组相比,SNI组脊髓背角的星形胶质细胞、小胶质细胞明显激活(P0.05),IL-1β的表达明显增加(P0.05);SNI+pDC515/eNR2B组和SNI+ mAbNR2B组的星形胶质细胞、小胶质细胞仍存在明显激活(P0.05),与SNI组相比变化无统计学意义(P0.05),并且SNI+pDC515/eNR2B组和SNI+ mAbNR2B组IL-1β的表达虽然较SNI组明显减少(P0.05),但仍较Na?ve组高(P0.05);SNI+pDC515组星形胶质细胞仍处于激活状态(P0.05);SNI+Ifen组及SNI+Morph组脊髓背角星形胶质细胞的激活及IL-1β的高表达显著受到抑制,与SNI组相比有统计学意义(P0.05),并且与Na?ve组相比(P0.05),SNI+Ifen组脊髓背角小胶质细胞的激活也明显受到抑制,与SNI组相比有统计学意义(P0.05)。结果提示,pDC515/eNR2B免疫及腹腔直接给与mAbNR2B在脊髓水平作用机制相似,即发挥镇痛作用的同时,可能激活了星形胶质细胞、小胶质细胞;而腹腔直接给与吗啡及Ifenprodil在脊髓水平均可抑制星形胶质细胞的激活,从而pDC515/eNR2B免疫及腹腔直接注射mAbNR2B治疗与腹腔直接注射吗啡及Ifenprodil相比较,在脊髓水平仍存在细胞因子IL-1β的高表达。 SNI+pDC515/eNR2B免疫血清、mAbNR2B、Ifenprodil处理均可明显降低谷氨酸损伤PC12细胞胞内游离钙离子荧光强度(P0.05),而吗啡处理无此效果。 5.统计学分析实验结果以±s表示,采用SPSS 12.0软件,缩爪阈值采用重复测量数据方差分析;其余结果比较采用单因素方差分析。研究结论与总结从噬菌体随机十二肽库中成功筛选到了能与NR2B特异性抗体结合的短肽,该肽模拟了天然抗原的某个表位。成功地构建和制备了高纯度、高浓度的N-甲基-D-天门冬氨酸受体NR2B亚基表位DNA疫苗。NR2B亚基表位DNA疫苗可以诱导SD大鼠产生特异性NR2B抗体,并可持续一定时间。该疫苗免疫SD大鼠后的免疫血清对PC12细胞的生长特性无影响,免疫所产生的特异性NR2B抗体可降低谷氨酸损伤引起的胞内钙离子浓度的升高。通过诱导机体产生特异性NR2B抗体,NR2B表位DNA疫苗可以抑制慢性神经性病理痛大鼠的痛觉过敏和痛觉异常行为,其镇痛效果较超常规剂量(10mg/kg)的吗啡差,与腹腔给与NR2B的抗体mAbNR2B(10mg/kg)或NR2B的选择性拮抗剂Ifenprodil(10mg/kg)的镇痛效应相似,但持续时间较二者长。NR2B表位DNA疫苗的镇痛效应与其通过特异性自身抗体下调腰段脊髓组织中NR2B的高表达从而降低细胞内游离钙离子水平有关。另外,我们虽然观察到了NR2B表位DNA疫苗免疫及腹腔注射mAbNR2B、Ifenprodil、吗啡等不同处理对慢性神经病理痛大鼠脊髓组织中星形胶质细胞、小胶质细胞及细胞因子IL-1β表达的改变,但由于只观察了免疫后25d时的一个时点而未进行动态监测,因此,对基因免疫进行疼痛治疗中的免疫机制还需更深入的研究。本研究通过从噬菌体随机十二肽库中筛选N-甲基-D-天门冬氨酸受体2B亚基的模拟表位,利用基因重组技术合成NR2B表位基因片断并克隆入真核表达载体中,从而成功构建了重组质粒pDC515/eNR2B,并经过扩增、纯化得到高浓度、高纯度的NR2B表位DNA疫苗。采用肌肉注射法免疫SD大鼠后即可获得满意的免疫效应,并可有效地抑制慢性神经病理性痛的痛觉过敏和痛觉异常等行为学改变。同时,通过检测免疫血清对PC12生长特性的影响及对谷氨酸损伤PC12的保护作用,和脊髓水平神经胶质细胞、小胶质细胞及细胞因子IL-1β的变化,对该疫苗的安全性及作用机制进行了初步探讨。因此,本研究为基因免疫治疗慢性神经病理性疼痛的可行性、有效性及安全性做了探索性工作,并得到了初步肯定的结果,为进一步深入细致的研究奠定了基础。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2007
【分类号】：R392

【参考文献】