抗汉滩病毒囊膜糖蛋白单克隆抗体的制备、鉴定及G2在毕赤酵母中的表达鉴定

发布时间：2018-03-04 16:35

本文选题：汉滩病毒　切入点：囊膜糖蛋白　出处：《第四军医大学》2007年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】： 肾综合征出血热(hemorrhagic fever with renal syndrome,HFRS)是由汉坦病毒(Hantanvirus,HV)引起的一种急性病毒性传染病,临床上以发热、出血、肾功能损害和免疫功能紊乱为突出表现。我国是世界上HFRS疫情最严重的国家,流行地区广、发病人数多、病死率较高,防治任务十分艰巨。 HV属于布尼亚病毒科(Bunyaviridae)汉坦病毒属。目前可将HV分为十种血清型或二十几种基因型,其中常见的对人类造成危害比较严重的型别有:汉滩病毒(HTNV)、汉城病毒(SEOV)、普马拉病毒(PUUV)、辛若柏病毒(SNV)等。以往国内外的大量研究工作表明,HV的M基因编码的囊膜糖蛋白(Glycoprotein,GP)是重要的结构蛋白,HV的中和抗原表位主要分布在GP上,特别是G2上。GP可刺激机体产生中和抗体,对感染动物和人体均具有保护作用。此外,GP还具有血凝活性、细胞融合活性及受体结合活性,因此GP被认为是一种重要的保护性抗原,是汉坦病毒基因工程疫苗的主要候选成份。但是,该蛋白免疫原性较弱,已有的抗GP的抗体亲和(结合)活性均不高,并且在目前应用比较广泛的几种表达系统中,GP表达水平亦不理想。因此也尚未建立针对GP的有效的检测方法,这些都使得对GP的研究受到了很大的限制。本研究根据GP上既有中和活性位点又有血凝活性位点的特点,利用HTNV 76-118株血凝素免疫小鼠制备单克隆抗体(mAb),并以含有G1、G2编码基因的真核载体G1-pDisplay、G2-pDisplay转染的CHO细胞筛选抗G1和G2的特异性mAb,对这些mAb的免疫学特性进行了初步鉴定;同时将编码HTNV 76-118株G2的基因片段分别克隆入毕赤酵母胞内型表达载体pPIC3.5K和分泌型表达载体pPICZαA,转化酵母工程菌株,筛选阳性转化子并进行了诱导表达。 1.抗HTNV G1、G2 mAb的制备及鉴定以蔗糖-丙酮法从HTNV 76-118株感染的乳鼠脑中提取血凝素,以此血凝素免疫BLAB/c小鼠,取免疫小鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合,以血凝抑制试验(HIA)进行筛选,获得了4株能稳定分泌抗HTNV血凝素mAb的杂交瘤细胞系,分别命名为1A6、1G12、2B2和2H5。用分别含有编码HTNV G1和G2基因的真核表达载体G1-Display、G2-Display转染CHO细胞,并用此转染细胞检测上述4株mAb。结果表明,mAb 1G12与G1-Display转染CHO细胞呈阳性反应,提示其是G1特异性的;2B2和2H5均与G2-Display转染CHO细胞呈阳性反应,提示它们是G2特异性的;而1A6则与G1-Display转染CHO细胞和G2-Display转染CHO细胞均呈阳性反应。采用HIA检测mAb 1A6、1G12、2B2、2H5腹水的血凝抑制效价,结果分别为1∶4000、1∶16000、1∶16000和1∶8000。中和试验的结果表明,4株mAb均有一定的中和活性,最高中和效价为1∶40。 2.HTNV G2蛋白在毕赤酵母中的表达与鉴定将HTNV 76-118株G2基因片段分别克隆入毕赤酵母胞内型载体(pPIC3.5K)和分泌型载体(pPICZαA),构建了含有编码HTNV G2蛋白基因的表达载体pPIC3.5k-G2和pPICZαA-G2,分别转化毕赤酵母工程菌后用甲醇诱导表达。用SDS-PAGE和Western-Blot对表达产物进行鉴定。结果表明,pPICZαA-G2转化菌表达产物中有与预期大小相符的目的蛋白条带,采用抗his的mAb及HFRS患者恢复期血清的Western-Blot,证实该条带为G2蛋白。本研究获得的针对HTNV GP(G1、G2)的特异性mAb以及HTVN G2蛋白,为进一步建立HTNV GP的检测方法以及HTNV GP的结构与功能研究等提供了物质基础。
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【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2007
【分类号】：R392

【参考文献】