脓毒症单核巨噬细胞特异性结合肽的筛选与鉴定

发布时间：2018-03-04 16:18

本文选题：脂多糖　切入点：脓毒症　出处：《南方医科大学》2007年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】： 脓毒症(sepsis)是由各种致病微生物或其毒素引起的全身炎症反应综合征(systemic inflammatory response syndrome，SIRS)，进一步发展可导致感染性休克(septic shock)、急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS)和多器官功能障碍综合征(mutiple organ dysfunction syndrom,MODS)等，脓毒症及其并发症一直是导致重症监护病房(intensive care unit,ICU)患者高发病率和高死亡率的主要原因，其中SIRS死亡率接近26％，脓毒症休克的死亡率更可高达82％。尽管付出了巨大的努力，但由于脓毒症发病机制复杂，临床治疗困难，近40年来预后一直没有实质性的改善，已经构成对人类健康的严重威胁和经济发展的巨大负担，是危重病医学面临的棘手问题。内毒素是G~-菌细胞壁外膜的结构成分之一，其化学本质为脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)，是引起脓毒症的主要因素。在SIRS及脓毒症发病机制的研究中，目前较为公认的是“二级炎症反应理论(second hit theory)”：LPS首先诱发单核巨噬细胞产生多种炎症介质，后者进一步激活单核巨噬细胞、内皮细胞、中性粒细胞等多种效应细胞，并形成瀑布效应，使炎症反应扩大甚至失去控制，最终导致以细胞自身破坏为特征的全身性炎症反应。LPS作用于单核巨噬细胞是脓毒症发病的始动环节，对这一环节进行深入研究并有效干预，则可以达到阻止下游级联反应，从而减轻炎症反应的目的。单核巨噬细胞在受到LPS诱导刺激后，自身的结构和功能发生改变，并导致相应的合成和分泌功能发生变化。与正常单核巨噬细胞相比较，受刺激细胞表面许多分子的活性部位暴露，一些与病理相关的分子新表达或表达增高，提示受刺激的细胞与正常的细胞表面存在着结构上具有差异的分子，这些分子可能与脓毒症的发生发展密切相关，并有可能作为脓毒症治疗的靶点。这些差异分子有可能是炎症级联反应时某些重要炎症介质的结合位点，寻找到这些差异分子的特异性结合肽，则有可能通过竞争性抑制相应炎症介质与效应细胞的结合，进而中和或阻断这些炎症介质的生物学效应，如进一步激活靶细胞释放细胞因子、介导细胞黏附等，从而达到阻断或减轻全身性炎症反应发生的目的，这种对特定细胞具有靶向治疗作用的生物活性肽的特点是更为高效和副作用小。其关键步骤为发现LPS刺激单核巨噬细胞的特异性高亲和力结合肽。近年来，以噬菌体展示(phage display)技术筛选肽类药物的蓬勃发展为解决上述问题提供了良好的契机。已经知道，蛋白质之间的相互作用和识别是通过局部肽段的相互作用实现的，而含有关键残基的短肽可以模拟蛋白质功能决定簇的作用。因此利用噬菌体展示技术筛选脓毒症单核巨噬细胞的特异性结合肽(该肽有可能阻断某些炎症介质的生物学效应)，将为脓毒症的防治提供新思路。噬菌体展示技术是20世纪90年代发展起来并得到广泛应用的新技术，其原理是将外源多肽或蛋白与噬菌体的一种衣壳蛋白融合表达，融合蛋白将展示在噬菌体的表面，而编码这个融合子的DNA则位于该噬菌体内。噬菌体展示技术的一个最基本的特征是将表现型和基因型有效联系起来，，即噬菌体表面的特定表现型与噬菌体颗粒中的基因型信息相对应，如需得到某个特定的表现型，只需在噬菌体基因组中插入该表现型的相关基因即可。噬菌体展示技术使大量随机多肽与其DNA编码序列之间建立了直接联系，使各种靶分子(抗体、酶、细胞表面受体等)的多肽配体通过一种被称为淘选(panning)的体外选择程序得以快速鉴定。最简单的淘选程序，是将噬菌体展示肽库与包被有靶分子的平板(或磁珠)共温育，先洗去未结合噬菌体，然后洗脱特异性结合的噬菌体。被洗脱的噬菌体进行扩增，然后再进行下一轮的结合／扩增循环，以富集那些可结合序列。经3～4轮淘选后，通过DNA测序对每个可结合克隆进行定性。展示在噬菌体表面的随机肽库可应用于许多方面，包括绘制抗原表位图谱、研究蛋白质-蛋白质相互作用和鉴定非肽配体的肽模拟物。生物活性肽分子的鉴定既可通过对固定的纯化受体进行淘选也可在完整细胞上进行淘选。 Ph.D.-C7C噬菌体展示肽库是将随机七肽融合到M13噬菌体次要衣壳蛋白(pⅢ)上而构建成的一个组合文库。所展示的随机多肽两侧各有一个半胱氨酸(Cys)。在非还原条件下，这两个半胱氨酸自发地形成一个二硫键，使展示的多肽环化。受限于二硫键环内的7肽库已被证实能识别抗原表位结构、D-氨基酸靶分子的镜像配基及开发以多肽为基础的治疗药物等。细胞表面是一个复杂的生物体系，分布着大量的信号分子，这些信号分子反映了细胞的特性及其所处的功能状态，人们固然可以将这些分子纯化作为靶标来筛选细胞特异性的结合肽，但对于纯化困难或表达量少的受体，这种方法显得力不从心，而且固定的重组受体可能经历构像的改变和(或)翻译后修饰的缺失，另外，许多受体分子需要完整的细胞膜或与膜上其它亚单位形成复合物才能发挥作用。因此，为了解决上述问题，并尽可能接近体内环境，以完整细胞为靶标进行筛选不失为一种可尝试的选择。本研究即为在靶分子未知的情况下筛选完整细胞，这种筛选适用于复杂的经常改变细胞表面的细胞(如炎症时的单核巨噬细胞等)。我们选用Giordano等新建立的用于细胞差减筛选的“一步有机相分离法——生物淘筛和对筛选出的反应配体的快速分析(biopanning and rapid analysis of selective interactive ligands，BRASIL)”技术。其基本原理是：噬菌体肽库与正常细胞孵育后，置于有机相上层进行离心，留在上层水相中的未结合噬菌体进一步与发生某种病理改变(如LPS刺激)的同种细胞进行孵育，并且再次置于有机相上层进行离心，与病理状态的细胞结合的噬菌体通过离心力的作用进入有机相，这些结合的噬菌体再经过转染、扩增后进行下一轮筛选。BRASIL技术无需反复数轮的洗脱过程，因此大大减少细胞和配体的丢失。此外，还具有操作简便、快速等优点。我们分别以LPS刺激的THP-1细胞为特异性结合靶细胞，以未经LPS刺激的THP-1细胞为非特异性结合吸附细胞，对噬菌体展示环七肽库进行了4轮差减筛选，结合噬菌体得到较好富集，富集率约为155倍。随机选取1，800个噬菌体克隆，经过细胞—酶联免疫吸附试验(cell-ELISA)验证及DNA测序鉴定，共获得了1，033个阳性噬菌体，并根据插入序列推导出外源七肽的氨基酸序列。这些七肽序列中包含大量的三肽残基，其中一些三肽基序作为生化识别单元(biochemical recognition units)中的配基，往往是某些功能蛋白的模拟表位(mimotopc)，寻找这些模拟表位及其对应的功能蛋白具有重大意义。我们采用随机排列检验(randomized permutation test，RPT)的思想，应用混排(洗牌)算法(shuffling algorithm)，统计大量噬菌体展示七肽中某特定三肽出现的次数(丰度)及其显著性，结果1，033个阳性噬菌体展示七肽中包括有3，085个不同的三肽残基，其中丰度超过15的三肽有8个，丰度具有显著性的三肽有4个。然后，利用Clustal W软件对包含丰度具有显著性或丰度较高的三肽基序的七肽进行多序列比对(multiple sequence alignment)分析，并结合氨基酸的性质，在这些七肽中寻找特征性短肽基序(模拟表位)；通过在线BLAST服务，将这些短肽基序同人类蛋白质序列数据库(SWISS-PROT)进行相似性比对分析，获得所有已知的包含这些特征性短肽的人类蛋白；进一步应用SignalP和TMHMM预测软件筛选其中的分泌蛋白和跨膜蛋白，从中获得目的功能蛋白。经过以上生物信息学分析预测，我们获得了功能蛋白hTNF-α及其表位模拟肽ISPL。为进一步研究通过噬菌体展示技术筛选并且经过生物信息学分析得到的短肽基序与细胞结合的特异性以及在细胞上的定位，我们进行了细胞免疫荧光试验，结果证实KSFISPL噬菌体具有与LPS处理的THP-1细胞特异性结合的能力，其结合部位是细胞膜。进一步应用液相蛋白芯片(LiquiChip)技术检测KSFISPL噬菌体对hTNF-α诱导THP-1细胞释放IL-8的影响，结果表明KSFISPL噬菌体可以有效抑制hTNF-α诱导THP-1细胞释放IL-8的作用，并且这种作用依赖于噬菌体表面展示的KSFISPL肽。总之，本研究在靶分子未知的情况下，利用BRASIL技术，对LPS刺激和未经LPS刺激的单核巨噬细胞进行4轮反复“差减筛选”，获得与LPS刺激的单核巨噬细胞特异性结合的短肽序列，应用生物信息学技术对这些短肽序列进行分析和预测，并进一步鉴定预测得到的功能蛋白和表位模拟肽的生物学活性。通过以上研究，我们得出以下几点结论： 1．经过实验证实，“一步有机相分离法——生物淘筛和对筛选出的反应配体的快速分析(BRASIL)技术”这种全新的完整细胞筛选技术操作简便、快速，可减少细胞和配体的丢失，增加对配体回收的灵敏度和特异性，值得推广应用； 2．通过BRASIL“差减筛选”，获得了1，033个与LPS刺激的单核巨噬细胞特异性结合的阳性噬菌体克隆，经过生物信息学分析，1，033个阳性噬菌体展示七肽中共包括有3，085个不同的三肽残基，其中丰度超过15的三肽有8个，丰度具有显著性的三肽有4个； 3．应用Clustal W软件并结合氨基酸性质，分别对包含丰度最高和丰度具有显著性的三肽基序的所有七肽进行多序列比对分析，获得了多个具有表位模拟肽性质和功能的特征性短肽； 4．应用BLASTP程序与人类蛋白质序列数据库进行同源性比对分析得到包含以上特征性短肽基序的已知人类蛋白，进一步利用SignalP和TMHMM预测软件获得分泌蛋白和跨膜蛋白，从中选择了细胞因子hTNF-α及其表位模拟肽ISPL进行功能鉴定； 5．免疫荧光实验证实，展示KSFISPL七肽的噬菌体具有与LPS处理的THP-1细胞特异性结合的能力，其结合部位是细胞膜，并且这种结合能力依赖于噬菌体表面展示的KSFISPL肽而非噬菌体自身； 6．液相蛋白芯片(LiquiChip)技术检测表明KSFISPL噬菌体可以有效抑制hTNF-α诱导THP-1细胞释放IL-6的作用，这种作用依赖于噬菌体表面展示的KSFISPL肽而非噬菌体自身；本研究应用分子生物学技术获得原始数据，运用生物信息学研究方法分析生物数据，预测出与疾病发生发展相关的功能蛋白及其表位模拟肽，再进行生物实验验证，是一条高效的研究途经。
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【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2007
【分类号】：R459.7;R363

【参考文献】