海藻糖在免疫检测体系中的应用及其生物活性保护效应的研究

发布时间：2018-03-04 22:39

本文选题：海藻糖　切入点：免疫检测　出处：《第一军医大学》2007年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】： 海藻糖(trehalose)是一种由两个葡萄糖分子以α，α，1，1-糖苷键构成的非还原性二糖，广泛存在于包括海洋生物海藻在内的多种动植物与微生物体内，，自身的化学及生物性质非常稳定。由于其能在高低温、高渗透压及失水等条件下在细胞表面形成独特的保护膜，有效地保护蛋白质等大分子的生物活性，被广泛应用于生物技术领域作为活性物质的保护剂。我们在实验中发现，适当浓度的海藻糖溶液不仅可以有效减轻高低温环境、时间以及固定剂、防腐剂对于细胞及其结合抗体活性的影响，而且可以在多种不同的免疫检测体系中显著提高信噪比，提高免疫检测的效率。一、海藻糖封闭液在不同免疫检测体系中的应用我们首先选取了免疫检测体系中应用最为普遍的酶联免疫吸附检测(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)作为评价体系。实验中，我们分别选择了抗原包被直接法检测抗体、抗原包被直接法检测抗血清、抗原包被间接法检测抗体、抗原包被间接法检测抗血清以及双抗体夹心法检测抗原等不同的ELISA体系进行研究，同时选择了5％脱脂奶粉封闭液、10％小牛血清、3％牛血清白蛋白(BSA)封闭液以及酪蛋白封闭液等常用封闭缓冲液作为对照检验不同浓度海藻糖封闭液对于检测体系检测敏感度与特异性的影响。结果表明，在各种不同的检测体系，特别是糖结合抗原抗体反应体系中，海藻糖封闭液均能够在不影响检测体系敏感度的前提下有效减少抗体的非特异性吸附，从而达到提高检测体系信噪比的目的，满足了检测体系对于封闭液的要求，而在部分非特异性吸附较强的血清检测体系、尤其是较为特殊的糖结合抗原抗体反应体系中，海藻糖封闭液的封闭效果优于5％脱脂奶粉封闭液等经典封闭液，为实验者提供了更好的选择。此外，高渗的海藻糖溶液可以在不添加防腐剂的条件下保持较长时间的性状，相对于传统蛋白封闭液的抗菌要求无疑为实验者提供了更大的便利。随后，我们又使用蔗糖、果糖等其他二糖封闭液与海藻糖封闭液进行了比较，结果显示，海藻糖封闭液的封闭效果明显优于果糖封闭液，而蔗糖封闭液基本不具备封闭效应。在海藻糖封闭液应用于ELISA体系的实验得到有效结果后，我们分别选择了另外四种常用的免疫检测体系检验海藻糖封闭液的适用范围。在斑点酶联免疫吸附检测(Dot-ELISA)与和Western Blot等以以PVDF膜为基质的抗原抗体反应体系体系中，海藻糖封闭液与其他传统封闭液相比同样表现出了优异的封闭效果，表明海藻糖封闭液在不同固相基质的抗原抗体反应检测体系中均能够发挥明显的封闭功效。在得到了以上令人鼓舞的结果后，我们试图将海藻糖封闭液应用于细胞免疫组织化学检测体系、细胞免疫荧光检测体系以及流式细胞术中，实验结果表明海藻糖同样具良好的封闭效果，但与传统封闭液比较未显示其能够有效增强以上免疫检测体系信噪比的功能。尽管以上检测体系中的封闭液应用仍有争议，但实验结果也从另一方面展示了海藻糖封闭液宽广的应用前景。综合以上实验结果以及海藻糖目前活性研究的进展，我们推测，海藻糖封闭液的作用机制可能基于其在固相基质表面所形成的网络化结构，阻止蛋白的非特异性吸附，从而达到增强信噪比的功能，而不具备网络化结构的蔗糖与网络化程度较弱的果糖则未能达到同样理想的效果。而在以细胞为研究对象的检测体系中，复杂的网络化结构则对海藻糖应用的条件优化提出了更高的要求。二、海藻糖对于抗体及细胞活性的保护作用已知，海藻糖可以通过在高低温、高渗透压及失水等条件下在细胞表面形成独特的保护膜，有效地保护蛋白质等大分子的生物活性。这提醒我们关注并探索海藻糖溶液能否对于免疫检测体系中细胞以及抗原、抗体等大分子物质的活性同样具有保护效应。首先，我们以温度与时间作为变量检测不同浓度的海藻糖溶液对于高温环境下蛋白的活性是否具有保护效应，实验表明，海藻糖溶液可在20天内有效保护37℃以上、60℃以下高温环境中预包被板抗原以及抗体的生物活性，极大满足了生物分子运输、储存以及应用的需要，验证并丰富了文献中关于海藻糖保护大分子物质生物活性的论述。但是，在检测海澡糖是否对于酶标抗体的稳定性也具有保护作用的实验中，海藻糖却并未能够表现出明显的优势。同时，针对防腐剂的使用常常影响大分子活性而给日常应用带来诸多不便的情况，我们使用高渗的海藻糖溶液与传统的叠氮纳以及不影响生物活性的新型防腐剂Proclin300进行了比较，结果显示，高渗的海藻糖溶液不仅可以防止污染，而且能够有效保护抗体活性，同时在价格上具有绝对优势。最后，我们结合以上实验的结果以及文献中对于海藻糖有效保护细胞稳定性的论述，对海藻糖溶液在流式细胞术中的应用进行了探讨。针对流式细胞术检测样本制备与上机不同步的情况，对海藻糖溶液能否有效保护待检样本细胞以及抗体的活性与形态进行了探讨。结果表明，海藻糖对于处理后样本的保护性并不显著，其应用有待摸索。综上，我们不仅验证了海藻糖溶液在异常温度以及脱水干燥情况下对于细胞以及部分大分子物质的活性保护效应，而且为海藻糖溶液在抗体保护以及流式细胞术等免疫检测体系中的应用提供了新的思路。
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【学位授予单位】：第一军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2007
【分类号】：R392

【参考文献】