立氏立克次体外膜蛋白B基因的应用研究

发布时间：2018-03-06 18:24

本文选题：立氏立克次体　切入点：实时荧光定量PCR　出处：《中国人民解放军军事医学科学院》2007年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】： 立氏立克次体(Rickettsia rickettsii)是落基山斑点热(Roeky Mountain Spotted Fever,RMSF)的病原体，为专性细胞内寄生的小革兰氏阴性菌，人对其十分易感。外膜蛋白B(rOmpB)是立氏立克次体最主要的表面蛋白抗原，被认为是发展落基山斑点热诊断试剂和亚单位疫苗的靶分子。本研究首先依据立氏立克次体ompB基因序列设计特异性引物和探针，以克隆的ompB基因片段为DNA模板，在ABI 7900型荧光定量PCR检测仪上建立实时荧光定量PCR检测方法。建立的定量标准曲线Ct值与模板拷贝数呈良好线性关系，最低检测浓度为5拷贝/μl，与普通PCR相比较，，敏感性是普通PCR的100倍；用该方法检测其它相关立克次体和常见非立克次体病原菌，检出结果均为阴性。用该荧光定量PCR方法检测立氏立克次体感染的豚鼠血液标本、小鼠脾脏标本及细胞培养标本，检测的结果与立氏立克次体感染进程相关。表明本研究建立的检测立氏立克次体实时荧光定量PCR方法具有高特异性和高敏感性，适用于定量检测各种样本中的立氏立克次体和立氏立克次体感染早期的实验室诊断。本研究还克隆表达了rOmpB的主要抗原片段—120kDa表面蛋白，并对重组蛋白的免疫原性和抗原性进行了研究。利用抗原表位预测技术，将120kDa蛋白分为抗原表位比较集中的六段蛋白，通过优化条件，利用不含胰化蛋白胨的新型MDG培养基实现了120kDa蛋白和六个蛋白片段在大肠杆菌的表达。免疫印迹分析证明重组蛋白中仅120kDa重组蛋白和5号蛋白(P5)能与立氏立克次体免疫血清特异反应。用纯化的七个重组蛋白免疫小鼠，IFA检测表明120kDa和P5蛋白能诱导小鼠产生较高水平的特异性IgG抗体。对免疫小鼠的脾脏做体外淋巴细胞增殖试验，发现120kDa蛋白和P5蛋白能诱导较高水平的淋巴细胞增殖。采用RT-PCR方法检测免疫小鼠脾淋巴细胞被不同蛋白抗原刺激后的细胞因子表达，发现120kDa蛋白和P5蛋白刺激的小鼠脾淋巴细胞均表达了IFN-γ、IL-2、IL-4和IL-10。结果证明120kDa蛋白和P5蛋白均能诱导机体产生高水平的特异性体液免疫和细胞免疫应答，具有良好的免疫原性。对重组蛋白免疫的小鼠进行攻毒试验，攻毒试验后小鼠主要脏器内病原体载量的定量检测结果表明，120kDa和P5重组蛋白组与灭活全菌抗原组之间没有显著性的差别，显示了良好的免疫保护性。 120kDa蛋白和P5蛋白可与立克次体属的多种立克次体免疫血清发生交叉反应，与贝氏柯克斯体、恙虫病东方体不反应，提示这两种蛋白具有立克次体属特异性。在ELISA实验中，分别以全菌抗原、120kDa蛋白和P5蛋白为包被抗原检测立氏立克次体阳性鼠血清的结果类似，表明作为ELISA诊断的包被抗原，P5蛋白可以取代全菌抗原和重组120kDa蛋白。以IFA结果为金标准，在立氏立克次体阳性和阴性鼠血清的检测中，以P5为包被抗原的ELISA方法的敏感性与特异性分别为100％和93.4％，表明重组P5蛋白是一个很有希望的立克次体感染的血清学诊断抗原。
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【学位授予单位】：中国人民解放军军事医学科学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2007
【分类号】：R376

【引证文献】