Pten缺失的小鼠胚胎成纤维细胞的蛋白质组分析

发布时间：2018-03-08 15:24

  本文选题：PTEN　切入点：活性氧　出处：《青岛大学》2006年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：Pten作为第一个被发现的具有磷酸酶功能的抑癌基因,在多种肿瘤中存在高频率缺失或突变。据估计,总体突变率相当于著名的肿瘤抑制基因p53,是目前肿瘤研究的热点基因之一。 培育基因敲除小鼠是深入研究基因功能的最重要手段之一,先后有四家实验室成功培育了Pten的基因敲除小鼠。MEF1/Pten~(-/-)和MEF2/Pten~(-/-)是由Hong wu博士的实验室建立的PTEN缺失的胚胎成纤维细胞株,是由原代培养的PTEN基因敲除小鼠的胚胎成纤维细胞永生化而来,我们以此为试验模型开展研究。 为了研究PTEN调控细胞各项生命活动的新机制,第一阶段:我们采用蛋白质组学技术来进行蛋白筛选,首先通过双向电泳技术,比较了PTEN缺失的胚胎成纤维细胞与正常胚胎成纤维细胞蛋白表达谱,发现在两株不同的PTEN缺失的胚胎成纤维细胞中有明显表达差异的蛋白,随后利用质谱技术鉴定及生物信息学检索分析,找出在Pten基因敲除小鼠的胚胎成纤维细胞中,抗氧化酶Cu/Zn-SOD、PeroxiredoxinⅤ-Ⅵ,细胞迁移相关蛋白Cofilin 1、GDI2,其他如LMW-PTP、Tagln 2等十多个表达差异蛋白;第二阶段:对筛选出的差异表达蛋白进一步进行分子生物学技术鉴定,并对部分蛋白进行了相应的生物学活性检测。在此研究中,我们主要采用MEF2/Pten~(-/-)细胞系作为试验对象,对MEF1/Pten~(-/-)细胞系的蛋白质组学结果只作为参照研究,结果如下: 1.在Pten基因敲除小鼠的胚胎成纤维细胞中,Northern blot及Western blot结果显示:Cu/Zn-SOD在mRNA及蛋白质表达水平均高于正常胚胎成纤维细胞,而且酶活性也明显增强;以流式细胞仪进行荧光探针标记活性氧检测发现:细胞中O_2含量明显增加。提示Pten基因敲除后,细胞内发生了氧化应激反应,O_2的增加及AKT信号的增强刺激了Cu/zn-SOD的表达。 2.在Pten基因敲除小鼠细胞中,通过Northern blot及Western blot检测,结果显示:在PRX家族中,PRX Ⅰ-Ⅴ在mRNA及蛋白质水平均高表达,但只有PRX Ⅵ低表达。流式细胞仪检测细胞内H_2O_2含量明显下降,在给予0.5mM H_2O_2刺激后,细胞内H_2O_2水平发生了翻转,明显高于对照细胞,而正常对照细胞中变化不明显。结果提示在Pten敲除细胞中,氧化与抗氧化平衡已被破坏,细胞内PRX家族在清除H_2O_2方面可能发生了重要作用。在Pten基因与氧化剂之间、SOD与PRX Ⅵ之间可能存在着负调控。 3.Pten基因敲除后,Northern blot及RT-PCR结果显示,细胞中迁移相关蛋白Cofilin 1表达上调,而GDI2显示下调,符合恶性肿瘤的转移表型。 4.其他蛋白:LMW-PTP,Tagln2 mRNA低表达,与细胞生长、增殖的信号转导有关。 通过本研究我们发现,Pten基因敲除后,细胞内发生了氧化应激反应,原有的氧化与抗氧化平衡失调,总体抗氧化能力下降,抗氧化酶Cu/zn-SOD和PRX的表达也产生了适应性调整,氧化剂与PTEN之间可能存在着负调控,并有AKT信号通路的参与。检测出的其它几种蛋白状
[Abstract]:......
【学位授予单位】：青岛大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2006
【分类号】：R-332

【共引文献】

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本文编号：1584451