人增生性瘢痕成纤维细胞（HHSFb）压应力效应及其分子机制初探

发布时间：2018-03-09 06:02

  本文选题：压应力　切入点：增生性瘢痕　出处：《第三军医大学》2007年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】： 机械应力作用于活体细胞,研究其受应力作用后的各种变化,是近十年来细胞生物学研究领域发展十分迅速的研究方法。业已证明,人体细胞生长在机体提供的微动力学环境中,机械应力不仅能引起细胞形态、结构变化,还能调控细胞的功能状态,影响细胞的增殖、分化及凋亡,在某些生理和病理过程中起着重要作用。目前研究较多的集中在生理、病理条件以及治疗过程中受到机械应力作用的细胞,如骨细胞(研究骨延长技术、加压固定治疗骨折技术、骨质疏松症机制等)、血管平滑肌细胞(研究高血压发病机制)、肾小球系膜细胞(研究肾小球高血压)、椎间盘细胞(研究椎间盘突出症)以及各类干细胞等,并取得了长足的进展。增生性瘢痕(Hyperplastic Scar,HS)是临床上的常见病、多发病。由于其发病机制不明,治疗遂缺乏有效手段。HS的组织学研究证实,大量排列紊乱的成纤维细胞及其分泌的细胞外基质过度沉积是构成HS的重要基础,因而对其成纤维细胞的研究是目前HS防治研究领域的焦点。 有关HS的治疗,目前临床上均采用综合治疗,其中压迫疗法对早期HS的治疗有效已在临床上达成共识,但就其治疗所提供压应力的大小、治疗时机、持续时间以及相关的分子机制尚不十分明确。既往研究提示,压应力对HS的血供能产生影响,导致HS组织缺血(或淤血)、缺氧,从而抑制HS的生长。然而对压应力条件下增生性瘢痕成纤维细胞(HSFb)本身生物学特性的改变上尚关注甚少。为此,深入认识压应力对HSFb形态、增殖、凋亡的影响,以及相关分子机制,无疑对临床上更加合理的运用压迫疗法治疗HS提供重要的理论基础。 本研究拟以人增生性瘢痕成纤维细胞(Human Hyperplastic Scar Fibroblast,HHSFb)为对象,通过自行研发的简易气控加压细胞培养仪(国家发明专利受理号:20061006717178.3),予细胞施加不同大小,持续不同时间的压应力,采用多学科的技术和方法,观察HHSFb生长特性(形态、增殖、凋亡)的变化,并初步探讨其量效关系及相关分子机制。 方法 1)应用组织块培养法获取HHSFb。以简易气控加压细胞培养仪予细胞施以5、10、15、25、50、100、150mmHg的持续压应力(每组n=6)4天,不施压设为对照组(n=6)。分别以四甲基偶氮唑(MTT)法测定细胞A值并计算其生长抑制率、流式细胞仪测定细胞生长周期及Annexin-V-PI标记法测定细胞凋亡情况。 2)将HHSFb随机分为对照组(未施压)、持续施压组(25 mmHg,6～8天)和施压(25mmHg,3～4天)后去除压应力组。分别以MTT法测定细胞生长抑制率、流式细胞仪测定细胞生长周期、免疫组化观察增殖细胞核抗原(PCNA)的表达及Annexin-V-PI标记法测定细胞凋亡情况。 3)将HHSFb随机分为对照组(未施压)、持续施压组(25 mmHg,12h),提取蛋白应用免疫印迹法(Westernblot)测定HHSFb信号传导分子p38MAPK磷酸化和Caspase-3活化情况。 结果 1)5mmHg、10mmHg压应力组细胞A值(0.228±0.004,0.226±0.003)、DNA合成前期(G1期)细胞百分比(71.80±0.44%,72.32±0.40%)与对照组细胞A值(0.230±0.005)、G1期细胞百分比(71.46±0.49%)相比较无统计学差异(P＞0.05);但15、25、50、100、150mmHg压应力组细胞A值(0.213±0.005、0.180±0.005、0.172±0.007、0.165±0.004、0.164±0.004),G1期细胞百分比为(74.56±1.01%,82.82±2.76%、86.77±2.06%、88.23±1.27%、89.11±1.74%)与对照组相比较有统计学差异(P＜0.05);其中10、15、25、50压应力组组间比较差异显著(P＜0.01),细胞增殖抑制率、G1期细胞百分比与压应力大小呈正相关;50、100、150mmHg压应力组的上述结果组间比较无统计学差异(P＞0.05),细胞抑制率、G1期细胞百分比随压应力增加增长不明显。5mmHg、10mmHg压应力组细胞早期凋亡率(4.22±0.49%,5.12±0.74%)与对照组(4.00±0.36%)相比较无统计学差异(P＞0.05);但15、25、50、100、150mmHg压应力组细胞早期凋亡率(8.58±0.79%、19.28±1.40%、25.60±1.21%、35.80±2.39%、36.18±2.3%)与对照组相比较有统计学差异(P＜0.05);其中10、15、25、50、100压应力组组间比较差异显著(P＜0.01),细胞凋亡率与压应力大小呈正相关并随压力增加细胞凋亡率显著增强;100、150mmHg压应力组的上述结果组间比较无统计学差异(P＞0.05),细胞早期凋亡率随压应力增加增长不明显。 2)25 mmHg持续压应力对HHSFb的生长抑制率随加压时间的延长逐渐增大;与对照组相应时相点比较,PCNA表达降低,处于增殖期(S+G_2+M)细胞比例减小;细胞凋亡率随施压时间延长逐渐增加;而施压后去除压应力继续培养观察显示,HHSFb的抑制率逐渐回降,PCNA表达增加和增殖期(S+G_2+M)细胞比例“反弹”增大,细胞的凋亡率也逐渐下降。 3)人增生性瘢痕成纤维细胞持续施压12h后,p38MAPK的磷酸化和Caspase-3活化明显增强。 结论 压应力(大于15 mmHg)对人增生性瘢痕成纤维细胞具有直接抑制增殖、诱导凋亡的复合效应,其中p38MAPK和Caspase-3是增生性瘢痕成纤维细胞压应力效应的重要信号分子。结合临床上压迫疗法具体运用的综合考虑,25 mmHg左右的压力可能较为适宜,但不宜超出50mmHg,且需要早期、持续和长期维持。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2007
【分类号】：R329;R622

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