诱生内源性IFN-γ的日本血吸虫抗原表位PDDV的构建与筛选

发布时间：2018-04-06 05:08

  本文选题：日本血吸虫　切入点：表位　出处：《南京医科大学》2007年硕士论文

【摘要】： 血吸虫病是一种世界范围内分布的主要公共卫生疾病，全世界约2亿多人受感染。在所有能够引起肝纤维化的疾病中，血吸虫病是其中的主要病因。而肝纤维化及门脉高压是日本血吸虫病人死亡的主要原因。 动物实验及人群调查研究发现，严重肝纤维化的形成与较强的Th2类免疫反应及较弱的Th1反应明显相关。研究证明CD4~+Th2细胞是影响血吸虫病肝脏免疫病理的主要因素，其中IL-13和IL-4是导致肝脏纤维化的主要细胞因子，IL-10、IL-12、IFN-γ在阻止慢性血吸虫病形成严重肝纤维化中起重要作用，其中Th1类细胞因子IFN-γ对肝纤维化的抑制作用已经获得临床研究的证实。为了探讨日本血吸虫抗原所诱导的Th1类免疫应答对日本血吸虫感染引起的肝纤维化的下调作用，为预防和治疗血吸虫病肝纤维化开辟一条新路，也对其它疾病所致的肝纤维化的免疫治疗提供一定的参考资料，本研究将以往研究获得的4个日本血吸虫抗原T细胞表位构建成PDDV(peptide-DNA dual vaccine)疫苗，并且从中筛选能诱导优势Th_1类免疫应答的一种或几种PDDV，以期进一步用于血吸虫感染急性期及慢性期小鼠模型，观察其对肝纤维化的下调作用。研究包括以下主要内容及结果： 研究内容一：本研究室以往研究获得4个日本血吸虫T细胞表位P4、P6、P18和P22。首先我们设计并合成4个表位肽的编码DNA，利用低熔点胶存在条件下的基因重组方法，将4种表位编码基因分别与CpG ODN(1826)或IL-12基因(作为核酸疫苗佐剂)重组进入pCI-neo质粒载体，通过酶切、PCR初步鉴定获得阳性克隆，经过测序及序列比对证明重组克隆与设计的序列完全一致。 将合成的带有18个赖氨酸(K18)的阳离子表位肽与带有阴离子电荷的重组质粒载体的HBS溶液按照一定的电荷比值进行配比，制备成一定盐浓度的多肽-DNA复合物溶液—PDDV(peptide-DNA dual vaccine)溶液。为了获得高质量的PDDV，即阳离子肽能有效包裹DNA免于被核酸酶所降解，，并且使PDDV大小为20nm左右，形态均一的颗粒，我们进行了沉淀试验、阻滞试验、DNaseⅠ消化试验及电镜观察，发现在盐浓度为150mM，阳离子与阴离子电荷比值(r)为4时制备的PDDV为符合以上条件的高质量的PDDV。 研究内容二：将4种表位肽与含有表位肽编码基因及IL-12基因的重组质粒按照研究一中获得的条件制备4种PDDV：[K]_(18)P_4-pCI-P_4-IL-12、[K]_(18)P_6-pCI-P_6-IL-12、[K]_(18)P_(18)-pCI-P_(18)-IL-12、[K]_(18)P_(22)-pCI-P_(22)-IL-12及4种PDDV的等量混合物。将四种表位肽与含有相应的表位肽基因及CpGODN1826的重组质粒制备另外4种PDDV：[K]_(18)P_4-pCI-P_4-CpG1826、[K]_(18)P_6-pCI-P_6-CpG1826、[K]_(18)P_(18)-pCI-P_(18)-CpG1826、[K]_(18)P_(22)-pCI-P_(22)-CpG1826及4种PDDV的等量混合物。另外，使用不含表位肽基因而只含有CpG ODN或者IL-12的质粒与K18制备的PDDV([K]_(18)-pCI-neo(?)CpG1826、[K]_(18)-pCI-neo-IL-12_(12))作为阴性对照。使用溶剂HBS作为以上所有组的空白对照免疫小鼠C57BL／6(共分13组，见后)。3次免疫后剖杀小鼠，分离、培养脾脏及淋巴结细胞，通过增殖试验观察再次使用抗原肽刺激后淋巴细胞增殖反应水平；取细胞培养上清检测IFN-γ及IL-4水平。结果发现：动物免疫分组情况1、[K]18P4-PCI-P4-IL-12 2、[K]18P6-PCI-P6-IL-12 3、[K]18P18-PCI-P18-IL-12 4、[K]18P22-PCI-P22-IL-12 5、以上4种PDDV的等量混合物6、[K]18-PCI-neo-IL-12 7、[K]18P4-PCI-P4-CpG1826 8、[K]18P6-PCI-P6-CpG1826 9、[K]18P18-PCI-P18-CpG1826 10、[K]18P22-PCI-P22-CpG1826 11、以上4种PDDV的等量混合物12、[K]18-PCI-neo-CpG1826 13、HBS 1、第8组([K]_(18)P_6-pCI-P_6-CpG1826 PDDV免疫组)使用SWAP及表位肽[K]_(18)P_6刺激后淋巴细胞增殖水平都明显高于阴性对照组，并且IFN-γ水平较阴性对照组明显升高(p＜0.01，而[K]_(18)P_6刺激IL-4水平较阴性对照组低，并且具有统计学意义，表明[K]_(18)P_6-pCI-P_6-CpG1826 PDDV能够较强诱导Th1类免疫应答，P6很可能是优势诱导Th1类免疫应答的表位。 2、使用4种表位分别与IL-12基因重组质粒制备的PDDV混合物免疫小鼠后(第5组)，淋巴细胞增殖高于4种PDDV分别免疫组(第1、2、3、4组)的表位肽刺激的淋巴细胞增殖水平。用4种表位及含有CpG ODN重组质粒制备的PDDV混合物免疫组(第11组)的淋巴细胞增殖水平也明显高于四种PDDV分别免疫组。此外，第5组IFN-γ水平及IL-4升高也很明显，以IL-4升高更为显著，因此我们认为几个表位的混合PDDV的作用要较单个表位的PDDV的作用相对较强。而用4种表位分别与含有CpG ODN的重组质粒制备的PDDV混合物免疫小鼠后(第11组)，淋巴细胞明显增殖的同时，IFN-γ的产生明显下降，而IL-4水平则有所升高，提示4种表位PDDV混合后可能既能诱导Th1类免疫应答，又能诱导Th2类免疫应答。 因此在这4种表位中有可能既有Th1类表位，又有Th2类表位，但此结论为一次实验所得结果，尚需再次实验验证。 综上，本研究用基因重组技术获得分别含有P4、P6、P18、P22 4种表位基因及CpG ODN的4种重组质粒，及此4种表位与IL-12基因的重组质粒。通过沉淀试验、阻滞试验、DnaseⅠ消化试验及电镜观察，确定在NaCl浓度为150mM、阳离子与阴离子电荷比值为4时，可制备出形态均一、大小约为20nm、且能够有效抵抗核酸酶的消化作用的PDDV颗粒。通过动物免疫，淋巴细胞增殖试验及培养细胞上清中细胞因子IFN-γ及IL-4水平检测，鉴定出表位P6为Th1表位，P6与pCI-P_6-CpG1826制备的PDDV诱导的Th1类应答最为明显。
[Abstract]:schistosomiasis is one of the major public health diseases distributed worldwide , and some 200 million people worldwide are infected . In all diseases that can cause liver fibrosis , schistosomiasis is the main cause of schistosomiasis , and liver fibrosis and portal hypertension are the main causes of the death of schistosomiasis patients in Japan .






In order to study the effect of Th1 type immune response induced by Schistosoma japonicum on liver fibrosis induced by Schistosoma japonicum infection , it has been proved that IL - 13 and IL - 4 are the main factors leading to liver fibrosis .






In this study , four epitopes of T cell epitopes of Schistosoma japonicum were designed and synthesized . Four epitope peptides were designed and synthesized . Four epitope - encoding genes were recombined with CpG ODN ( 1826 ) or IL - 12 ( as a nucleic acid vaccine adjuvant ) into pCI - neo plasmid vector .






A new solution - PDDV ( peptide - DNA dual vaccine ) was prepared by mixing cationic epitope peptide with 18 lysine ( K18 ) and recombinant plasmid vector with anionic charge according to a certain charge ratio . In order to obtain high - quality PDDV , it was found that PDDV was a high - quality PDDV which accords with the above conditions when salt concentration was 150 mM , and the ratio of cation to anionic charge ( r ) was 4 .






Four kinds of PDDV were prepared by the recombinant plasmid containing the epitope peptide gene and the IL - 12 gene . Four kinds of PDDV were prepared from the recombinant plasmids containing the corresponding epitope peptide gene and CpGODN1826 .
The levels of IFN - 纬 and IL - 4 were detected in cell culture supernatant . The results showed that the immune grouping of the animals was 1 , that K - 18P4 - PCI - P4 - IL - 12 , K - 18P18 - PCI - P18 - IL - 12 , K - 18P18 - PCI - P18 - CpG1826 - 9 , K - 18P6 - PCI - P18 - CpG1826 - 10 , K - 18P18 - PCI - P18 - CpG1826 10 , K - 18P6 - PCI - P18 - CpG1826 10 , K - 18P18 - PCI - P18 - CpG1826 10 , K - 18P18 - PCI - P18 - CpG1826 10 ,






( 18 ) P _ 6 - pCI - P _ 6 - CpG1826 PDDV was able to induce Th1 immune response .






In addition , the levels of IFN - 纬 and IL - 4 in the PDDV mixture prepared by recombinant plasmids containing CpG ODN were significantly higher than those of four PDDV groups ( Group 11 ) .






Therefore , it is possible to have both Th1 type epitopes and Th2 type epitopes in these four epitopes , but this conclusion is the result of one experiment .






In this study , four kinds of recombinant plasmids containing P4 , P6 , P18 , p22 , four epitope genes and CpG ODN were obtained by gene recombination . The results showed that when the concentration of NaCl was 150 mM , the ratio of cation to anionic charge was 4 , it was determined that the level of PDDV induced by PDDV was the most obvious when NaCl concentration was 150 mM , the ratio of cation to anionic charge was 4 . The results showed that the level of PDDV induced by PDDV was most obvious by animal immunity , lymphocyte proliferation assay and cytokine IFN - 纬 and IL - 4 levels .

【学位授予单位】：南京医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2007
【分类号】：R392

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本文编号：1718085