乙胺丁醇作用于耻垢分枝杆菌（Mycobacterium smegmatis）mc～2155的蛋白质组学

发布时间：2018-04-13 01:37

本文选题：乙胺丁醇 + 耻垢分枝杆菌mc~2155　；参考：《大连医科大学》2007年博士论文

【摘要】： 结核病(tuberculosis, TB)是由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)引起的传染性疾病,曾在世界范围广泛流行,为严重的全球性健康问题之一。近年来,由于多耐药性(muti-drug resistant, MDR)菌株的出现和HIV(Human Immuno deficiency Virus)的协同作用,使得结核病卷土重来,成为当今世界三大传染病之一。因此,开发和研制新一代抗结核药物已迫在眉睫,而开发新药的途径之一就是利用阐明现有药物的作用机制来筛选和设计新药。抗结核的一线药物之一乙胺丁醇(Ethambutol,EMB)是抑菌剂,对细胞外繁殖期的结核分枝杆菌的生长有抑制作用,且不表现出明显的耐药性。一直以来,乙胺丁醇的直接作用靶点被认为是合成聚阿拉伯半乳糖的关键酶之一,即阿拉伯糖基转移酶(arabinosyl transferase)。对其可能的作用机理推断之一是,乙胺丁醇通过与阿拉伯糖基转移酶竞争性结合,抑制了阿拉伯糖基的转移,从而影响了细胞壁分枝菌酸-聚阿拉伯半乳糖-肽聚糖复合物的形成,使其它药物如利福平更易进入细胞而出现协同抗结核作用。但是,美国科罗拉多州立大学微生物系Mike McNeil教授的一项实验结果显示,乙胺丁醇并不直接抑制阿拉伯糖基转移酶的活性。并且,在结核分枝杆菌的培养基中加入乙胺丁醇后,细胞壁中的聚阿拉伯糖在短时间内大量流失,该现象提示乙胺丁醇作用方式与聚阿拉伯糖水解酶的增多有关。在此基础上,辛毅首次发现了M.tuberculosis的模式菌——耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis, M.smegmatis)中一种内源性聚阿拉伯糖水解酶的存在。吴雪琼等人的研究显示,在69株乙胺丁醇耐药菌株中约有63.8%的耐药菌株的阿拉伯糖基转移酶embB的结构并没有发生改变,这些结果提示,乙胺丁醇对阿拉伯糖基转移酶的作用可能并不是直接的。那么,乙胺丁醇的直接作用目标是什么?是单一的还是多靶点的?迄今为止,这些问题仍悬而未决。为了揭示乙胺丁醇的作用机制,本论文试图利用蛋白质组学的方法,分析比较乙胺丁醇处理前后M. smegmatis mc2 155(以下简称mc2 155)菌株蛋白质组的变化情况,从蛋白质组水平寻找乙胺丁醇特有的作用靶标,以期发现更多与乙胺丁醇作用相关的基因,为阐明这些基因的功能和相互关系提供前期工作基础。从应用前景来看,这些工作将为新药的开发提供有价值的作用靶点,并为新型抗结核药物的开发和研制提供线索和依据。本课题内容包括:1)于600 nm处,分别测定不同浓度的乙胺丁醇处理前后mc2 155的光吸收值,绘制细菌生长曲线,确定乙胺丁醇处理的最佳时间和浓度。以异烟肼、利福平这两种抗结核一线药物为对比,利用载体两性电解质等电聚焦双向电泳分析比较乙胺丁醇(EMB)、异烟肼(INH)、利福平(RIF)处理mc2155后的蛋白质表达谱,在蛋白质组水平,证实乙胺丁醇抗结核作用的独特性,为后续工作奠定基础并提供依据。2)收获最佳药物处理时间和浓度的耻垢分枝杆菌mc2 155菌体,超声破碎法制备可溶性的总蛋白样品,采用载体两性电解质等电聚焦双向电泳(carrier ampholytes pH gradient two-dimensional electrophoresis, ISO-2DE)和固相pH梯度荧光差异显示双向电泳(fluorescence difference two-dimensional gel electrophoresis, 2D-DIGE)技术,观察乙胺丁醇处理前后mc2 155细菌总蛋白的变化情况。利用PDQuest软件和DeCyder胶内差异分析软件分析乙胺丁醇处理前后mc2 155的总蛋白表达谱,找到乙胺丁醇处理组特性表达的蛋白质斑点,进一步将乙胺丁醇处理后mc2 155细菌特异性表达的总蛋白质斑点进行胶内酶解消化,得到的短肽片段,通过电喷雾质谱(electrospray ionization mass spectrometry, ESI-MS)进行鉴定,将结果输入NCBInr数据库进行匹配、比对,采用Mascot系统进行评分,推测可能的蛋白质。3)利用去垢剂超速离心法,进一步提取乙胺丁醇处理前后mc2 155细菌的质膜蛋白,用载体两性电解质等电聚焦双向电泳分离mc2 155质膜蛋白,利用PDQuest软件分析找到药物处理后特异性表达的膜蛋白质斑点,将乙胺丁醇处理后mc2 155细菌特异性表达的质膜蛋白质斑点进行胶内酶解消化,得到的短肽片段,通过基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry, MALDI-TOF/MS)进行鉴定,将结果输入NCBInr数据库进行匹配、比对,采用Mascot系统进行评分,推测可能的蛋白质。从亚细胞蛋白质组水平寻找mc2 155细菌质膜上的乙胺丁醇的作用靶点,为进一步明确阐述乙胺丁醇的抑菌机制提供依据。4)选取表达差异性显著的蛋白质的氨基酸序列,通过结核分枝杆菌GeneBank和耻垢分枝杆菌GeneBank的同源性分析,确定蛋白的基因序列,分别设计引物,提取药物处理前后mc2155的mRNA,进行逆转录PCR(RT-PCR),观察乙胺丁醇处理后mc2 155特异性表达的蛋白质在mRNA水平的变化情况,以确认这些筛选出的基因表达的阳性率。本研究获得以下结果: 1)通过观察不同浓度的EMB处理前后耻垢分枝杆菌生长的变化,发现各浓度的EMB对耻垢分枝杆菌生长均有不同程度的抑制作用。药物处理3小时,细菌的增殖开始受到明显的抑制,最佳处理浓度为24.0μg /ml,抑菌率为26.43%。通过载体两性电解质等电聚焦双向电泳对EMB处理组,INH处理组和RIF处理组耻垢分枝杆菌细胞总蛋白质组差异比较时,发现三者间存在显著差异。 2)采用载体两性电解质等电聚焦双向电泳和固相pH梯度荧光差异显示双向电泳技术,对最佳处理浓度和时间的EMB处理前后的mc2 155可溶性总蛋白质进行分离,发现耻垢分枝杆菌细胞蛋白主要分布在pH 4.0～6.0范围内。利用PDQuest 7.3.1软件和DeCyder胶内差异分析软件处理,发现在pI值分布的任一区域,EMB处理组蛋白斑点数均少于空白对照组。对EMB处理后特异性表达的40个可溶性蛋白质斑点进行质谱鉴定和生物信息学分析发现这40个蛋白可大致分为分子伴侣、膜相关蛋白、转录翻译调节因子、酶、其它未知蛋白等五类。在特异性表达的蛋白中并未发现阿拉伯糖基转移酶(EmbB),提示乙胺丁醇对EmbB的作用可能并不是直接的。 3)利用去垢剂超速离心法分离纯化EMB处理前后mc2 155的质膜蛋白,通过载体两性电解质等电聚焦双向电泳方法对纯化后的质膜蛋白进行分离,发现EMB处理后特异性表达的蛋白质斑点主要出现在中低分子量区域,经质谱鉴定和生物信息学分析后,确定EMB处理后特异性表达的5个疏水性膜蛋白质分别为翻译延长因子Tu、钼生物合成协同因子A、CG30165-PA蛋白、儿茶酚2,3-双加氧酶、肌球蛋白重链样蛋白。 4)利用RT-PCR方法检测特异性表达蛋白的相关基因在mRNA水平上的表达规律发现,与空白对照组相比,brf和tpx基因在EMB处理组中均呈现较高的表达,而groL基因的表达则明显下降。brf、tpx和groL在mRNA水平的表达情况与蛋白表达水平相一致。结论: 不同浓度的EMB对耻垢分枝杆菌的增殖均有不同程度的抑制作用。耻垢分枝杆菌细胞蛋白主要分布在pH 4.0～6.0范围内。在蛋白质表达水平上,空白组和EMB处理组的蛋白确实存在显著差异。差异性表达蛋白质的发现为研究编码这些基因的相关功能和相互关系提供了研究对象,该结果同时提示,乙胺丁醇对分枝杆菌增殖的抑制作用可能是多位点、多途径的过程。未来研究方向: 1.用基因敲除方法进一步探讨乙胺丁醇处理后mc2 155中特异性表达的各蛋白质与聚阿拉伯糖代谢的相关性。 2.进一步研究这些基因在聚阿拉伯糖代谢中的特定的和确切的功能。
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【学位授予单位】：大连医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2007
【分类号】：R52;R378

【参考文献】