O1群小川型霍乱弧菌单克隆抗体的制备应用及其识别表位模拟肽的筛选鉴定

发布时间：2018-04-16 18:17

本文选题：霍乱 + O1群小川型霍乱弧菌　；参考：《重庆医科大学》2007年博士论文

【摘要】： 霍乱(cholera)是由霍乱弧菌引起的烈性肠道传染病,该病起病急、传播快、涉及范围广,可引起爆发流行,属国际检疫传染病,在我国被列为甲类传染病之一,从有记载开始霍乱已引起七次世界范围大流行,时时威胁着人类健康。霍乱弧菌血清群超过200个,但只有O1群及O139群引起霍乱大流行。O1群霍乱弧菌分为稻叶、小川和彦岛(少见)三种血清型,O139群不再分型。各型弧菌产生类似的肠毒素,临床表现也较为相似。目前对霍乱爆发的应答是以组织良好的紧急应答形式作出反应,虽然能防止许多死亡,但不能预防霍乱疫情的发生;每一次霍乱流行都会有一个特定的优势株,且流行趋势不断变化。因此,建立有效的快速反应机制和应对策略具有重要意义。霍乱的快速检验平台的建立有利于霍乱流行的监测与预防,通过针对霍乱弧菌的特异性单抗开发的胶体金试纸条,可快速、简便、准确地检测霍乱弧菌,无需特殊的仪器设备,适于现场和基层使用。疫苗则是从根本上消除霍乱威胁的最为有效手段,中期和长期预防措施的持续结合在霍乱防控中具有重要作用,所以开发安全高效的新型疫苗显得十分必要,其中有效疫苗候选表位的筛选是得到安全、高效的新型霍乱疫苗的关键,噬菌体随机肽库技术则是目前抗原表位高通量筛选最为有效的工具。在本课题中,我们采用灭活的O1群小川型、稻叶型及O139群霍乱弧菌为抗原,通过杂交瘤技术制备针对霍乱弧菌的单克隆抗体,并通过一步法配对筛选技术平台得到2株高特异性高活性的O1群小川型霍乱弧菌单抗IXiao3G6和IXiao1D9,并以此为基础研制成功O1群小川型霍乱的胶体金试纸条,为临床霍乱病例诊断、高危人群监测、流行病学调查及卫生检疫等提供快速、简便、准确的检测手段。在此基础上以IXiao3G6单抗为靶标,应用噬菌体随机肽库技术进行了霍乱弧菌模拟肽筛选,通过对筛选出的模拟肽(mimic peptide,MP)基因优化设计,实现串联重复,构建含模拟肽与霍乱毒素B亚单位(CTB)编码基因嵌合表达的重组质粒,并在大肠杆菌BL21中表达,鉴定其抗原性,为基于表位的霍乱弧菌模拟多肽疫苗的开发与设计提供实验基础。第一部分霍乱弧菌单克隆抗体的制备及筛选目的制备并筛选出高特异性高活性的抗霍乱弧菌单克隆抗体(McAb),为霍乱的预防诊断提供有力的抗体工具。方法以灭活的O1群小川型、稻叶型及O139群霍乱弧菌免疫Balb/c小鼠,通过杂交瘤技术制备针对霍乱弧菌的McAb,以间接ELISA法对所需的杂交瘤细胞株进行第一轮筛选,除了用O1群小川型、稻叶型及O139群霍乱弧菌的菌体抗原进行特异性筛选外,还选用了多种包括弧菌科及其他常见细菌在内的菌体抗原进行排除性筛选。第二轮筛选采用独特的“单抗金标平行快速筛选技术”建立单克隆抗体细胞株配对筛选技术平台,将纯化单抗标记胶体金和包被硝酸纤维素膜后两两组合配对筛选。结果用间接ELISA经特异性初筛,共筛选出602株能分泌抗O1群小川型霍乱弧菌单抗、386株能分泌抗O1群稻叶型霍乱弧菌单抗、82株能分泌抗O139群霍乱弧菌单抗的杂交瘤细胞株。此后重复进行间接ELISA特异性筛选及交叉反应筛选,得到15株只分泌抗O1群小川型霍乱弧菌的特异性McAb、15株只分泌抗O1群稻叶型霍乱弧菌的特异性McAb、10株只分泌抗O139群霍乱弧菌的特异性McAb的细胞株。经配对筛选,最后筛选出两株只针对O1群小川型霍乱弧菌高特异性高活性的单抗:X8 (IXiao3G6)和X2 (IXiao1D9)。结论获得两株只针对O1群小川型霍乱弧菌高特异性高活性的McAb,为O1群小川型霍乱早期快速诊断和预防的研究提供基础。第二部分特异性O1群小川型霍乱弧菌单克隆抗体的鉴定及应用目的本部分我们首先对所获得的2株只针对O1群小川型霍乱弧菌的单抗细胞株IXiao3G6和IXiao1D9进行理化性质的鉴定和生物学特性的研究,然后用这2株单抗研制O1群小川型霍乱弧菌胶体金快速检测卡,建立以单克隆抗体为基础的双抗夹心法膜式超灵敏胶体金快速检测方法,用于霍乱的早期诊断。方法首先对筛选到的高特异性的两株单抗进行了分离、纯化及鉴定:先通过饱和硫酸铵盐析的方法粗提抗体,再用Protein A亲和层析法进一步纯化,然后对单抗进行了包括染色体分析,亚型鉴定,效价、亲和常数的测定以及特异性的鉴定与分析,并通过单克隆抗体的位点相加实验、与O1群小川型霍乱弧菌LPS的间接ELISA和western blot实验对两株单抗识别的抗原表位进行了初步研究。然后采用高度特异性的抗原抗体反应及胶体金标记技术,通过双抗体夹心法(抗体-抗原-抗体),以2株单抗作为包被及标记抗体,制备胶体金-抗体结合物和反应膜,研制霍乱弧菌胶体金快速检测卡,并通过特异性、灵敏度、重复性及稳定性的检测进行方法学评价。结果SDS-PAGE结果表明,纯化后单抗纯度达95%以上,经鉴定两株单抗亚类分别为IgG2b及IgG3,特异性好、亲和力高(亲和常数为109)、效价高(腹水效价均达10-6),对两株单抗识别的抗原表位进行初步研究表明两株单抗针对的是不同抗原表位,IXiao3G6针对O1群小川型霍乱弧菌脂多糖,而IXiao1D9针对非脂多糖抗原位点。制备了O1群小川型霍乱弧菌胶体金快速检测试纸卡,实现对O1群小川型霍乱弧菌菌体抗原的特异检测,建立了单克隆抗体夹心法-胶体金试纸条检测霍乱弧菌的方法,初步试验结果证明,该法具有很好的特异性(100%)和灵敏度(最低检出量1×104cfu/ml),重复性100%,稳定性好(室温保存一年也不失活),检测时间快(5分钟可判定结果),操作简便等优点。结论对筛选到的高特异性的两株单抗进行分离、纯化及鉴定,进一步证实这两株单抗达到了诊断用抗体亲和力的要求,对下步模拟表位的筛选及获得能诱导保护性免疫反应的模拟肽也有重要的应用价值。O1群小川型霍乱弧菌胶体金快速检测卡能够特异检测O1群小川型霍乱弧菌,操作简单,结果判定清晰可靠,解决了现霍乱检测中无法对小川及稻叶型区别检测的问题,弥补了国内国际霍乱检测试剂盒的一个缺口和空白点,为临床诊断、食品安全检测、环境卫生监测、反恐和出入境检疫等提供有效的检测手段。第三部分O1群小川型霍乱弧菌单克隆抗体识别表位模拟肽的筛选鉴定目的以纯化的有高度特异性的IXiao3G6单抗为靶分子,对噬菌体随机7肽库进行淘筛,以期筛选到与O1群小川型霍乱弧菌单抗有高亲和力的模拟肽,为基于表位的霍乱弧菌模拟多肽疫苗的研制奠定基础。方法运用噬菌体随机七肽库技术,以纯化的IXiao3G6单抗为靶蛋白,进行噬菌体随机肽库3轮筛选,以双抗夹心ELISA和竞争抑制试验分析获得的噬菌体短肽与筛选配基的结合能力及特异性,并进行阳性克隆序列测定和同源性分析。结果三轮筛选后,阳性噬菌体得到有效富集,夹心ELISA检测随机挑取的25个噬菌体克隆,有22个噬菌体克隆为阳性,测序表明其中20个阳性克隆的氨基酸序列完全一致,均为APAIPAS。对该序列同源性分析,未发现有相同的已知序列。竞争抑制试验表明,O1群小川型霍乱弧菌LPS能很好地抑制阳性克隆与IXiao3G6 McAb的结合,抑制程度随LPS浓度的升高而增加,而对照细菌的LPS则不具有相应的抑制作用,进一步提示噬菌体克隆展示肽模拟了O1群小川型霍乱弧菌LPS抗原表位。结论筛选到模拟O1群小川型霍乱弧菌LPS的抗原表位的模拟肽,为基于表位的霍乱弧菌模拟多肽疫苗的开发与设计提供了实验依据。第四部分O1群小川型霍乱弧菌模拟肽与霍乱毒素B亚单位的重组表达及抗原性分析目的对筛选的模拟O1群小川型霍乱弧菌LPS抗原表位的MP基因实现串联重复,构建含MP与霍乱毒素B亚单位(CTB)编码基因的重组质粒,并在大肠杆菌BL21中表达,鉴定其抗原性,为进一步研制基于表位的霍乱弧菌模拟多肽疫苗奠定基础。方法用PCR方法扩增CTB目的基因片段,经Kpn I、BamH I双酶切后,与进行同样酶切处理的质粒pET32a(+)在T4连接酶的作用下连接,转化大肠杆菌JM109,通过鉴定、测序,构建pET32a(+)-CTB重组质粒。根据获得的O1群小川型霍乱弧菌LPS模拟表位对应的基因序列,设计寡核苷酸链,实现MP基因的串联重复,经PCR得到模拟肽的核苷酸链,克隆至重组质粒pET32a(+)-CTB的CTB基因下游,构建含嵌合基因的重组质粒pET32a(+)-CTB-MP,转化大肠杆菌BL21(DE30),通过IPTG诱导蛋白表达,Ni-NTA试剂盒纯化目的蛋白,用间接ELISA、western-blot检测其抗原性,用竞争抑制试验进一步验证MP是否模拟了O1群小川型霍乱弧菌LPS的抗原表位,还应用ELISA检测CTB与单唾液酸神经节苷脂GM-1的结合。结果实现了串联重复的O1群小川型霍乱弧菌LPS模拟肽(MP)与CTB的重组,SDS-PAGE显示,IPTG诱导后CTB和CTB-MP蛋白均获得高效表达,相对分子量分别为32KD和34KD,与预期相符,目的蛋白纯化后纯度可达90%以上。间接ELISA、western-blot检测表明CTB-MP融合蛋白可与IXiao3G6单抗结合,竞争抑制试验表明CTB-MP可抑制IXiao3G6单抗与O1群小川型霍乱弧菌及O1群小川型霍乱弧菌LPS的结合,通过ELISA表明CTB与单唾液酸神经节苷脂GM-1的结合。结论O1群小川型霍乱弧菌LPS模拟肽(MP)与CTB的重组蛋白可与O1群小川型霍乱弧菌单克隆抗体IXiao3G6反应,并可抑制IXiao3G6单抗与O1群小川型霍乱弧菌LPS的结合,提示该模拟肽可模拟O1群小川型霍乱弧菌LPS的表位。CTB与单唾液酸神经节苷脂GM-1能够结合,表明CTB在模拟肽重组蛋白中也起了作用。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2007
【分类号】：R392

【参考文献】