腺病毒载体介导的siRNA对3T3-L1细胞脂联素表达的影响

发布时间：2018-04-18 18:36

  本文选题：腺病毒载体 + 脂联素Acrp30　； 参考：《重庆医科大学》2007年硕士论文

【摘要】： 第一部分细菌内同源重组制备携带脂联素Acrp30 siRNA的腺病毒载体 目的细菌内同源重组法构建携带脂联素Acrp30的siRNA腺病毒载体。 方法首先将鼠U6启动子和脂联素Acrp30 siRNA的cDNA克隆入穿梭质粒pshuttle,卡那霉素抗性筛选阳性重组子,双酶切并测序鉴定正确后,将重组子用PmeⅠ线性化后电穿孔入电转化感受态细胞BJ5183,与pAdeasy-1在BJ5183内同源重组,PacⅠ消化鉴定产生30kb和4.5kb或3.0kb的为阳性重组子,将阳性重组子在超感受态菌XL10-Gold中扩增重组腺病毒质粒后,PacⅠ消化,脂质体介导转染AD293细胞,包装扩增携带脂联素Acrp30的siRNA重组腺病毒。 结果成功构建脂联素Acrp30 siRNA腺病毒载体,测得滴度为4.5×108;3.7×108;5.6×108 PFU/ml。 结论成功构建脂联素Acrp30 siRNA腺病毒载体,为下一步脂联素Acrp30 siRNA重组腺病毒在脂肪细胞内抑制脂联素表达打下基础。 第二部分腺病毒载体介导的Acrp30siRNA抑制脂肪细胞分泌脂联素 目的携带Acrp30 siRNA的重组腺病毒感染诱导分化成熟的3T3-L1脂肪细胞,检测Acrp30siRNA是否能有效抑制脂肪细胞脂联素的mRNA和蛋白的表达。 方法IBMX+胰岛素+地塞米松诱导方案诱导分化小鼠3T3-L1前脂肪细胞,用重组腺病毒(MOI100)感染脂肪细胞并设RNAi阴性对照,正常对照和空白对照,72h后用ELISA法检测细胞上清中脂联素蛋白的表达,RT-PCR法检测脂联素mRNA的表达。 结果携带Acrp30 siRNA的腺病毒载体能在脂肪细胞中显著抑制脂联素表达。 结论构建的Acrp30基因特异性siRNA腺病毒载体能有效的抑制脂联素在3T3-L1脂肪细胞中的表达,为进一步研究脂联素作用机制提供了新思路。
[Abstract]:Part I preparation of adenovirus vector carrying adiponectin Acrp30 siRNA by homologous recombination in bacteriaObjective to construct siRNA adenovirus vector carrying adiponectin Acrp30 by homologous recombination in bacteria.Methods the mouse U6 promoter and the cDNA of adiponectin Acrp30 siRNA were cloned into the shuttle plasmid pshuttle. kanamycin resistance positive recombinant was screened and identified by double enzyme digestion and sequencing.The recombinant gene was linearized by Pme 鈪，

本文编号：1769558