SARS-CoV 7a蛋白的结构与功能初步研究

发布时间：2018-04-30 07:17

  本文选题：SARS-CoV + ORF7a　； 参考：《中国人民解放军军事医学科学院》2006年硕士论文

【摘要】：SARS是近年来爆发的一种严重的呼吸道传染疾病，SARS-CoV是SARS的病原体。基因组测序结果显示，SARS-CoV除编码冠状病毒共有的结构蛋白M、E、S和N蛋白外，还存在6个编码氨基酸大于50的ORFs，，生物信息学分析没有发现这些ORFs的同源基因，推测其中可能存在SARS-CoV致病基因。在SARS-CoV特有的这些ORFs中，ORF7a即为其中之一。已有文献报道在SARS-CoV感染的细胞中可检测到ORF7a的表达，且其表达能诱导caspase依赖性的细胞凋亡，因此有理由认为7a可能是SARS-CoV的潜在致病基因。本课题拟对7a蛋白进行结构与功能初步研究，以期为揭示SARS-CoV致病的分子机制提供线索。 我们用免疫细胞化学方法对7a的细胞内定位及拓扑异构性进行研究，发现其定位于高尔基体，N端朝胞浆，C端朝内腔。同时我们在实验中注意到转染了7a的HEK293细胞与空细胞相比，增殖变得缓慢，推测其可能有增殖抑制作用。于是构建了N端或C端带有GFP或myc标签的7a真核表达载体，转染不同细胞系后检测细胞增殖情况，发现7a的表达可明显抑制细胞增殖，阻止BrdU掺入，提示7a可能起到细胞周期调控的作用。于是我们将7a转染HEK293细胞，转染后24-60h分别用流式细胞术分析细胞周期，结果显示，转染后不同时间点，7a的表达均能引起细胞周期G0／G1期阻滞，且转染COS-7和Vero细胞也可观察到相似结果。 为了找到7a中影响其定位和功能的结构域，我们构建了7a基因的系列缺失突变体，并对其进行定位和相关功能分析，发现决定7a定位和引起细胞G0／G1期阻滞以及凋亡的区域均位于蛋白的44-82个氨基酸处。 最后，进一步探索7a引起细胞G0／G1期阻滞的机制。Rb是细胞由G0／G1期进入S期的关键调控因子，可结合转录因子E2F并抑制其活性。Rb磷酸化受Cyclin／cdk复合物的调节，Rb高磷酸化后释放并激活E2F，启动S期基因转录。实验中我们主要通过Western blot的方法对这些影响细胞周期进程的蛋白因子进行研究，发现在HEK293细胞中，7a的表达可显著降低Cyclin D3转录水平和蛋白表
[Abstract]:SARS is a serious respiratory infectious disease in recent years. SARS-CoV is the pathogen of SARS. The results of genomic sequencing showed that there were six ORFs encoding amino acids more than 50 in addition to the structural proteins Mannes and N shared by SARS-CoV. The homologous genes of these ORFs were not found in bioinformatics analysis. It is speculated that there may be SARS-CoV pathogenic gene. ORF 7 a is one of these ORFs specific to SARS-CoV. It has been reported that the expression of ORF7a can be detected in SARS-CoV infected cells, and its expression can induce apoptosis of caspase dependent cells. Therefore, it is reasonable to think that 7a may be a potential pathogenicity gene of SARS-CoV. The aim of this study is to study the structure and function of 7a protein in order to provide clues for the molecular mechanism of SARS-CoV pathogenesis. The intracellular localization and topological isomerism of 7a were studied by immunocytochemistry. It was found that it was located in the C-terminal cavities of the cytoplasm of Golgi. At the same time, we observed that the proliferation of HEK293 cells transfected for 7 years was slower than that of empty cells. A 7a eukaryotic expression vector with GFP or myc tags on N-terminal or C-terminal was constructed. After transfection of different cell lines, cell proliferation was detected. It was found that 7a expression could significantly inhibit cell proliferation and prevent BrdU incorporation. These results suggest that 7 a may play a role in cell cycle regulation. So we transfected HEK293 cells for 7 years and analyzed the cell cycle by flow cytometry at 24-60 hours after transfection. The results showed that the expression of 7a at different time points after transfection could induce the arrest of G0/G1 phase of cell cycle. Similar results were observed after transfection of COS-7 and Vero cells. In order to find out the domain of 7a gene that affects its location and function, we constructed a series of deletion mutants of 7a gene, and analyzed its location and related functions. It was found that the regions determining 7a localization, G0/G1 arrest and apoptosis were located at the 44-82 amino acids of the protein. Finally, the mechanism of cell G0/G1 phase arrest induced by 7a was further explored. RB is the key regulatory factor for cell to enter S phase from G0/G1 phase. Binding to transcription factor E2F and inhibition of its activity. RB phosphorylation is regulated by Cyclin/cdk complex and release and activation of E2F after high Rb phosphorylation. In our experiment, we studied these protein factors that affect cell cycle progression by Western blot. We found that the expression of T7a in HEK293 cells could significantly reduce the transcription level and protein surface of Cyclin D3.
【学位授予单位】：中国人民解放军军事医学科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2006
【分类号】：R373

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本文编号：1823607