小鼠B7-H4重组腺病毒构建及鉴定

发布时间：2018-05-06 11:09

  本文选题：B7-H4 + 重组腺病毒　； 参考：《浙江大学》2007年硕士论文

【摘要】： T细胞的活化需要两个信号：第一信号是由TCR-MHC—抗原肽复合物引起T细胞交联并启动特异性抗原识别信号；T细胞活化的第二信号为共刺激信号，是由APC和T细胞表面多种粘附分子对组成。共刺激信号不仅能提供促进T细胞活化、增殖和细胞因子分泌的正性共刺激信号，，而且能传递、削弱和终止T细胞活化增殖的负性共刺激信号，它们在免疫反应的不同时相发挥各自的作用。B7-CD28分子家族是一类重要的调节免疫应答的共刺激分子。B7-1和B7-2及其受体CD28／CTLA-4代表经典的正性和负性共刺激信号途径。 B7-H4是由Sica等2003年发现的B7家族新成员。B7-H4 mRNA广泛地表达在外周组织：肾、肝、脾、肺、胸腺和胎盘等，但免疫组化分析正常的组织未见阳性反应。B7-H4在移植物抗宿主疾病(GVHD)等自身免疫性疾病组织及肺癌、卵巢癌、乳腺癌等细胞上均有高表达，说明B7-H4分子的表达在翻译水平上受到严格的调控；另外，体内外实验证明B7-H4分子可以抑制包括Th1型和Th2型细胞因子的分泌，如：IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ等。阻断B7-H4与其受体的相互作用，有望成为干预自身免疫性疾病和肿瘤生物治疗的潜在靶点。因此，B7-H4分子途径提供了对癌症、自身免疫性疾病和抗病毒及移植排斥反应等疾病新的治疗思路。 为更深入研究B7-H4的作用机制及在免疫耐受方面的应用，本实验利用AdEasy~(TM)XL系统构建携带小鼠B7-H4基因(mB7-H4)的重组腺病毒，并进行生物学活性鉴定。 方法：从小鼠肺组织中通过RT-PCR获取约870bp大小的目的基因，测序正确后克隆至穿梭载体pShuttle-CMV构建重组穿梭载体；PmeⅠ线性化重组穿梭载体质粒后电转化BJ5183-AD-1感受态细菌，以细菌内同源重组方式完成腺病毒骨架与穿梭质粒的同源重组，构建携带mB7-H4的重组腺病毒的质粒plasmid-mB7-H4／Ad；经人胚胎肾细胞(AD-293)包装后产生复制缺陷的重组腺病毒mB7-H4／Ad。提取感染重组腺病毒的AD-293细胞总RNA及总蛋白，以RT-PCR及Western Blot方法检测B7-H4 mRNA和蛋白的表达。重组腺病毒扩增三代后，用半数组织培养感染量(Tissue culture infectious dose 50，TCID50)方法检测腺病毒的滴度。最后，将重组腺病毒感染小鼠成纤维细胞(L929)，用感染了重组腺病毒的L929细胞进行T细胞增殖实验和细胞因子分泌水平的检测。 结果：重组腺病毒mB7-H4／Ad转染AD-293细胞3天后可观察到病变的出现，6～7天后，大部分细胞出现肿胀、脱落等细胞致病变效应(CPE)；RT-PCR检测表明B7-H4在AD-293细胞可正确转录；Western Blot检测显示mB7-H4／Ad表达的蛋白可与小鼠B7-H4 IgG单克隆抗体特异性结合，而且分子量大小与预期一致；病毒扩增三代后，病毒滴度达到2×10~8pfu／ml。感染了mB7-H4／Ad的L929细胞能够有效抑制抗小鼠CD3诱导的T淋巴细胞的增殖和细胞因子IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ的分泌水平，说明mB7-H4／Ad所表达的B7-H4分子具有生物学活性。 结论：本实验成功地构建了表达B7-H4的重组腺病毒mB7-H4／Ad，所构建的mB7-H4／Ad具有免疫抑制功能。
[Abstract]:Activation of T cells requires two signals : the first signal is caused by TCR - MHC - antigen peptide complexes which cause T cell cross - linking and initiate specific antigen recognition signals ;
B7 - CD28 molecule family is an important co - stimulatory molecule that regulates immune response . B7 - 1 and B7 - 2 and its receptor CD28 / T 4 - 4 represent classical positive and negative costimulatory signal pathways .









B7 - H4 mRNA was expressed in peripheral tissues : kidney , liver , spleen , lung , thymus and placenta .
In addition , in vivo experiments prove that B7 - H4 molecules can inhibit the secretion of Th1 - type and Th2 - type cytokines , such as IL - 2 , IL - 4 , IL - 10 , IFN - 纬 , etc . The interaction between B7 - H4 and its receptors is blocked , which is expected to be a potential target for the intervention of autoimmune diseases and tumor biological treatment .









In order to study the mechanism of B7 - H4 and its application in immune tolerance , the recombinant adenovirus carrying mouse B7 - H4 gene ( mB7 - H4 ) was constructed with AdEasy ~ ( TM ) XL system .









Methods : The recombinant shuttle vector pShuttle - CMV was cloned into shuttle vector pShuttle - CMV by RT - PCR in mouse lung tissue .
After Pme 鈪

本文编号：1852078