松果体激素的化学性质及其释放入脑脊液途径的形态学研究

发布时间：2018-05-08 07:23

  本文选题：松果体 + 血管周隙　； 参考：《河北医科大学》2007年博士论文

【摘要】： 松果体细胞带有突起,含有分泌颗粒;而且,支配松果体的神经纤维,也可以释放神经肽;因此,松果体内肽类物质,是位于松果体细胞,还是位于支配松果体的神经纤维,目前仍不十分确切。人们普遍认为,肽类激素分泌颗粒,是以胞吐分泌的方式释放;但也有学者认为,肽类激素分泌颗粒的释放形式,可能存在连同颗粒被膜的整体释放。由于松果体的毛细血管为窗孔型,相对缺乏血脑屏障,故多数学者认为,松果体细胞释放的分泌物,立即进入血液循环;也有学者认为,松果体分泌的褪黑素,可以直接释放到第三脑室或蛛网膜下隙的脑脊液中。对人和牛等的血液和脑脊液中,褪黑素浓度的分析表明,脑脊液中浓度通常高于血液数倍;所以,褪黑素有可能被直接释放入脑脊液,从而最快最有效地到达脑内的作用靶点。本研究课题,旨在探讨松果体肽类激素的化学性质和释放形式,观察松果体分泌物直接释放到蛛网膜下隙脑脊液途径的结构基础;为进一步阐明松果体的功能,也为临床相关疾病的诊治,提供形态学依据。 一、大鼠松果体细胞原代培养体系的建立 目的:建立体外培养的大鼠松果体细胞系,观察培养的松果体细胞在生长、增殖和功能状态等生物学方面的变化,探讨培养松果体细胞的最佳生长和功能状态时机,为摆脱神经及体液等因素对松果体的影响、揭示松果体细胞自身合成和分泌肽类激素,提供实验研究依据。 方法:于春季上午9:00~10:00,将颈椎脱臼法处死的生后1~3天SD乳鼠,经75%乙醇消毒后,将颅骨骨片向前掀起,游离粘连于颅骨上的松果体浅部,剥除脑膜及血管;将松果体剪碎,离心后加入0.125%胰酶和0.02%EDTA混合消化液,37℃消化15min;加入含10%新生牛血清、青霉素100IU/ml和链霉素100IU/ml的DMEM/F12培养液,终止胰酶消化,制备成单细胞悬液;接种于放有盖玻片的六孔板中,置于37℃含5%CO2饱和湿度的培养箱内,在上述混合培养基中培养;分别在接种后的第3、7、10、13天,半量更换混合培养基。每天定时在倒置显微镜下观察其生长情况;取培养第12天的细胞爬片,行免疫细胞化学染色,4%多聚甲醛固定1h,1%TritonX-100室温30min,一抗为兔抗人多克隆5-HT抗体工作液,4℃过夜;二抗为生物素标记的羊抗兔IgG工作液;应用辣根过氧化物酶标记链霉卵白素工作液、DAB显色;采用0.125%胰酶和0.02%EDTA混合消化液消化法,取培养到第15天的细胞,2 %多聚甲醛和2.5 %戊二醛混合固定液,4℃固定3h,进行常规TEM样品的制备与观察;取培养第15天的细胞爬片,1%戊二醛4℃固定1h,梯度乙醇脱水,自然干燥后镀金,SEM观察。 结果:在倒置显微镜下观察显示,在接种6h后,培养细胞贴壁;接种后的4天内,贴壁细胞增殖缓慢;接种后第5~6天,细胞增殖加快;在接种后的第7~8天,出现典型的培养细胞巢,为较暗的圆形、椭圆形、三角形或多角形的松果体细胞;在成纤维样细胞层的上方中央,呈铺路卵石样密集排列;第8~12天,细胞增殖旺盛,形成许多面积大小不一、细胞数量不等的细胞巢;在第12~15天,分散的、呈片状的成纤维样细胞层逐渐融合,其上的细胞巢内呈铺路卵石样排列的细胞逐渐分散,细胞巢变得不典型。在细胞巢的周边和细胞巢的空穴内,可见少量胞体较大、突起粗大的多边形神经胶质样细胞。在培养第12天的细胞爬片上,可见5-HT免疫反应阳性细胞,外观似双极神经元。TEM观察显示,体外培养15天的松果体细胞内,有丰富的粗面内质网和游离核糖体、密集的线粒体、少量直径300nm左右的膜包密芯分泌颗粒;在细胞质内,还可见到许多大小不等的囊泡。在体外培养15天的细胞爬片上,SEM观察显示,可见梭形和近似球形的松果体细胞。 结论:实验建立了大鼠松果体细胞体外培养体系,方法简单易行、价格低廉。在培养的第7~8天,出现典型的细胞巢,为较暗的圆形、椭圆形、三角形或多角形松果体细胞,位于成纤维样细胞层的上方中央,呈铺路卵石样密集排列。培养10～15天时,细胞生长状况较好,是进行免疫细胞化学研究,或做透射电镜观察的最佳时机。 二、大鼠松果体内生长抑素免疫反应阳性细胞和纤维的观察 目的:由于松果体细胞带有突起,又含有分泌颗粒;而且,支配松果体的神经纤维,也可以释放神经肽。然而,松果体内的肽类物质,是位于松果体细胞内,还是位于支配松果体的神经纤维内,目前仍不十分清楚。为此,本文旨在探讨松果体细胞,是否自身能够合成与分泌生长抑素样抑制性激素。 方法: 1松果体内生长抑素的免疫细胞化学观察 取15天龄SD大鼠,于春季上午9 : 00～11 :00,腹腔注射20 %乌拉坦麻醉下,左心室插管快速灌流0.9%温生理盐水,再用4℃的4%多聚甲醛灌注约1h,断头取松果体浅部,置于4℃的4%多聚甲醛中72h;冰冻切片,片厚14μm;1%TritonX-100室温30min,一抗为兔抗人多克隆生长抑素抗体工作液,4℃反应68h,二抗为生物素标记的羊抗兔IgG工作液;辣根过氧化物酶标记链霉卵白素工作液和DAB显色。 2生长抑素在培养大鼠松果体细胞的表达 取新生SD大鼠松果体,进行松果体细胞培养;取培养第12天的细胞爬片,4%多聚甲醛中固定1h,1%TritonX-100室温30min,一抗为兔抗人多克隆生长抑素抗体工作液,4℃反应36 h,二抗为生物素标记的羊抗兔IgG工作液;辣根过氧化物酶标记链霉卵白素工作液和DAB显色。 3松果体内生长抑素的免疫金电镜观察 取新生SD大鼠,于春季上午9 : 00～11 :00,断头,取松果体浅部,4℃的3 %多聚甲醛和1 %戊二醛中固定60min,4℃的4 %多聚甲醛中再固定2h;然后进行常规TEM样品包埋,超薄切片载于镊网上;一抗为兔抗人多克隆生长抑素杭体工作液,4℃反应70h;胶体金(15nm)标记羊抗兔IgG稀释液(1:10),37℃反应60min;醋酸铀和枸橼酸铅染色,透射电镜观察。 结果: 1松果体内生长抑素的免疫细胞化学观察 在15天龄的大鼠松果体,可见数量稀少的生长抑素免疫反应阳性细胞,其外观呈椭圆形或三角形,胞体直径大于其它背景染色细胞;其中有些阳性细胞,发出1~2条细长、生长抑素免疫反应阳性突起,走行于松果体实质细胞之间。在松果体实质细胞之间,偶尔可以见到结节状膨大的、生长抑素免疫反应阳性纤维。 2生长抑素在培养大鼠松果体细胞的表达 在体外培养第12天的细胞爬片上,可以见到生长抑素免疫反应阳性细胞;其胞体外观呈圆形、椭圆形、三角形或梭形,从胞体上发出2~3条细长的、生长抑素免疫反应阳性的突起。 3松果体内生长抑素的免疫金电镜观察 在生后1天的大鼠,松果体的实质细胞,主要由松果体细胞构成;其中,只有少量松果体细胞,含有大型致密核芯分泌颗粒,这些分泌颗粒的数量较少,在细胞质内呈散在分布或数个成堆分布。在应用树酯包埋后染色、免疫金电镜技术所做的超薄切片上,可在某些松果体细胞的胞浆内,观察到散在分布的或聚集成堆的标记金颗粒。 结论:在大鼠松果体内,存在生长抑素免疫反应阳性细胞和纤维。少量松果体细胞内,含有大型致密核芯分泌颗粒。少量松果体细胞的胞质内,含有生长抑素免疫反应阳性物质。有些体外培养的松果体细胞,可以合成和分泌生长抑素。 三、大鼠松果体分泌物释放入蛛网膜下隙脑脊液途径的结构基础 目的:哺乳动物的松果体,富含窗孔型毛细血管,相对缺乏血脑屏障。因此,多数学者认为,松果体细胞释放的分泌物,立即进入血管并经血液循环运输。由于人蛛网膜下隙脑脊液中的褪黑素浓度,显著高于血液中浓度;因此,松果体分泌物有可能通过脑脊液,直接到达脑内的作用靶点。多数学者认为,多肽激素的分泌颗粒,是以胞吐分泌的方式释放,但是也有学者认为,可能存在连同颗粒被膜的整体释放。为此,本文对大鼠松果体的细微和超微结构特点进行观察,为松果体细胞分泌颗粒的释放形式和转运途径,以及与蛛网膜下隙脑脊液的关系,提供形态学证据。 方法:于春季上午9:00～11:00,SD大鼠在腹腔注射20%乌拉坦麻醉下,直接断头取松果体浅部,12月龄大鼠的松果体,置于4℃的3 %多聚甲醛和1 %戊二醛溶液中,浸泡固定48 h,然后进行常规TEM样品的制备与观察;1.5月龄和12月龄的大鼠松果体,置于4℃的2 %多聚甲醛和2.5 %戊二醛混合固定液中,浸泡固定48h,然后进行松果体囊表面的常规SEM样品制备与观察;同时,12月龄大鼠在乌拉坦麻醉下,经左心室插管,快速灌注0.9%温生理盐水冲洗后,断头取松果体浅部,移入1%锇酸4℃固定1h,然后进行DMSO冷冻割断法的SEM样品制备及观察。 结果: 1 TEM观察 TEM观察显示,大鼠松果体毛细血管为窗孔型(孔径50nm),借基膜与宽阔的血管周隙分隔;松果体细胞与结缔组织之间,也有基膜相互分隔,相邻的松果体细胞则紧密相贴。在松果体细胞的连接面之间,局部细胞膜凹陷,形成大量管径不等的细胞间小管;其管腔面比较光滑,无基膜覆盖,有些小管内可见到膜壳和膜碎片样结构。但是,在构成细胞间小管的松果体细胞之间,未观察到紧密连接。松果体细胞间小管,与松果体内结缔组织间隙和血管周隙互相连通。松果体囊与软脑膜相延续,由扁平的囊上皮细胞和上皮下结缔组织构成;在上皮下结缔组织间隙内,可见松果体细胞的胞体及突起等结构。松果体囊扁平上皮细胞的排列,呈现两种不同的形式:一种是囊上皮细胞的扁平叶瓣,排列成叠瓦状,形成瓣膜样连接,平行的囊上皮叶瓣之间,宽处可达1μm;另一种是囊上皮细胞排列成单层,有些相邻的囊上皮细胞,其游离缘之间相互分离,形成直径约2.5μm的囊上皮孔。 2 DMSO冷冻割断法SEM观察 SEM观察显示,在大鼠松果体的割断面上,相邻的松果体细胞膜相对面凹陷,形成许多细胞间小管,宽阔的血管周(围结缔组织间)隙清晰可辨,细胞间小管与血管周隙相互交通。 3 SEM观察 松果体囊表面SEM观察显示,囊上皮细胞之间存在筛状和喇叭口状上皮孔。筛状上皮孔主要存在于1.5月龄大鼠的松果体囊,是由上皮细胞周边部的胞质突起,相互交织形成的圆形孔洞,直径约200~500nm;喇叭口状上皮孔见于1.5月龄和12月龄大鼠的松果体囊,是由相邻上皮细胞向松果体内部凹陷,形成圆形或椭圆形孔洞,孔径约1~4μm。在大鼠松果体囊表面,还可见到直径0.5~1μm的球形颗粒、膜壳和胞膜碎片,偶见圆形和多突起的巨噬样细胞。 结论:松果体细胞表面,可分为结缔组织间隙面、连接面和细胞间小管面三个功能面;相临的松果体细胞之间,局部细胞膜凹陷,形成互相连通的细胞间小管。大鼠松果体细胞分泌颗粒的释放形式,可能存在连同颗粒被膜的整体释放。松果体分泌物可通过结缔组织间隙面,释放入血管周隙;或通过细胞间小管面,释放入细胞间小管内。释放到松果体组织液中的分泌颗粒,可能通过血管周隙—细胞间小管—松果体囊结缔组织间隙—囊上皮瓣膜样连接或囊上皮孔,直接进入蛛网膜下隙的脑脊液中。由于渗透压等理化性质的改变,分泌颗粒膨胀,部分颗粒被膜破裂,释放出松果体激素微粒,随脑脊液转运和发挥作用。
[Abstract]:Therefore , it is believed that the release form of the peptide hormone secretion particles can be released directly into the cerebrospinal fluid of the third ventricle or the subarachnoid space .






Establishment of primary culture system of rat pinealocytes






Objective : To establish an in vitro cultured rat pinealbody cell line , to observe the changes of the growth , proliferation and functional state of the cultured pine nut cells , and to explore the optimal growth and functional status of the cultured pine nut cells , and to reveal the influence of the factors such as nerve and body fluid on the pinealbody , and to reveal the synthesis and secretion of peptide hormones in the pine body cells , and provide experimental research basis .






Methods : After disinfection of 75 % ethanol , the cells were cultured in DMEM / F12 medium containing 10 % fresh bovine serum , penicillin 100IU / ml and streptomycin 100IU / ml . The cells were cultured in DMEM / F12 medium containing 10 % fresh bovine serum , penicillin 100IU / ml and streptomycin 100IU / ml .






Results : After 6 hours of inoculation , the cells were cultured and the cells were cultured for 4 days .






Conclusion : The culture system of rat pinealocytes in vitro is established , and the method is simple and easy to implement , so the price is low and factory - direct.We even have the best time to observe the growth of rat pinealocytes in the middle and middle of the fiber - like cell layer .






Observation on the immunoreactive cells and fibers of somatostatin immunoreactive cells in the pinealbodies of rats






The aim of this study is to investigate whether or not to synthesize and secrete somatostatin - like inhibitory hormones .






Method :






Immunocytochemical observation of somatostatin in pine body






Sprague - Dawley rats aged 15 days were perfused with 0.9 % warm physiological saline at 9 : 00 - 11 : 00 a.m . in the spring , and then perfused with 4 % polyformaldehyde at 4 鈩，

本文编号：1860485