p53和p38对UV诱导的细胞凋亡的抑制效应及其机制研究

发布时间：2018-05-15 01:24

本文选题：p38丝裂原活化蛋白激酶 + p53　；参考：《第一军医大学》2007年博士论文

【摘要】： 细胞凋亡在肿瘤发生、胚胎发育、免疫反应、神经系统发育和组织细胞代谢等过程中起重要作用。凋亡失调是当今威胁人类健康的许多重大疾病的重要发病机制之一。例如，细胞凋亡异常在许多恶性肿瘤的发生、发展中起着至关重要的作用。然而，尽管目前对于凋亡调控机制的研究已经相当深入，但存在着许多研究结果相互矛盾的现象，这极大地影响了肿瘤的基础研究与临床治疗。因此，有必要探讨这些相互矛盾的结果，从而在肿瘤的基础研究领域取得突破，来服务于临床肿瘤治疗。丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)是信号从细胞表面传导到细胞核内部的重要传递者。p38是4个MAPK亚族之一，主要参与应激与炎症反应。研究表明，p38 MAPK还参与细胞恶性转化和肿瘤细胞浸润转移等病理过程，其对细胞周期和凋亡的调控是其生物学功能的重要方面。在不同细胞类型、不同刺激种类或强度的情况下，p38 MAPK活化所导致的细胞生物学效应可能有所不同，有时甚至完全相反。另外，当使用的研究方法不同时，得出的结果可能也大相径庭。例如，以往的大量研究都表明，在多种刺激下，p38被磷酸化激活来介导细胞凋亡。但也有报道在某些情况下p38对细胞凋亡具有保护作用。因此，p38 MAPK的活化到底是促进凋亡还是抑制凋亡，目前尚存在争议。肿瘤抑制基因p53是目前研究最为广泛和系统的抑癌基因之一。野生型p53参与了DNA损伤修复、细胞周期调控、细胞凋亡及抑制血管生成等过程。p53基因的突变使上述功能丧失，从而导致肿瘤的形成。尽管一般认为p53的活化主要导致细胞周期抑制和细胞凋亡，从而发挥其“分子警察”的作用，但也有研究表明，p53的活化在某些情况下对细胞具有保护作用，使细胞免于死亡。这提示p53信号通路的活化除了可以导致生长抑制和凋亡，也可以通过激活与生存相关的信号通路，从而在受到DNA损伤刺激时来维持细胞存活和死亡之间的平衡。因此，p53活化的最终结果是导致细胞凋亡还是细胞存活，可能也与刺激形式、强度、作用时间以及细胞类型有关。大量研究表明，p38 MAPK与p53在调控细胞凋亡中具有重要的功能联系。例如，在正常的人类角质细胞中，中波紫外线(ultraviolet radiation B，UVB)刺激可使p38激活，随后活化的p38在Ser~(15)位点磷酸化p53。这种p38依赖的磷酸化导致p53在细胞质中积聚，从而阻止了p53转位入核，发挥对紫外线诱导的细胞死亡的保护作用。而在兔关节软骨中，一氧化氮诱导活化的p38可磷酸化p53的Ser~(15)位点，引起p53蛋白的积聚并导致凋亡。这些结果提示p38 MAPK对p53的磷酸化激活既可能导致细胞凋亡，也可能使细胞存活。另外，不但p38 MAPK可磷酸化激活p53，p53也可以通过其转录活性的调节来反作用于p38 MAPK。例如，Wip1可能是以一种负反馈(negative feedback)的方式来调控p38-p53信号通路，从而防止该信号通路的过度激活。尽管p38 MAPK和p53在细胞凋亡中都具有重要作用的观点已被广泛接受，但两者在细胞凋亡调控中的确切作用仍存在着不同观点，这可能是由于采用的研究方法、系统和细胞系不同的缘故。基因敲除作为一种重要的蛋白质功能研究手段，其结果较其它方法更为可靠，对于阐明蛋白质的功能具有结论性的作用。因此，为了澄清p38 MAPK和p53在细胞凋亡中的作用和两者之间的功能联系，有必要利用p38 MAPK或p53基因敲除细胞来阐明其在不同刺激条件下的确切生理功能。在本研究中，我们选取紫外线(ultraviolet，UV)照射作为刺激因素，首先研究了p38 MAPK受到UV照射后磷酸化激活的动力学过程，结果发现，p38 MAPK在受到UV刺激后30 min即显著激活，约60 min～120 min达到峰值，刺激后240min又回到静息水平。与p38 MAPK不同的是，p53受到UV刺激后15 min即开始激活，约60 min时达到峰值，然后保持持续激活的状态，而并不回到初始水平。这说明p38 MAPK与p53的磷酸化激活具有不同的细胞动力学过程。为了进一步明确在细胞受到UV刺激的情况下，p38 MAPK是否能够介导p53的磷酸化，我们利用p38 MAPK特异性抑制SB203580预处理阻断p38 MAPK细胞信号通路，观察其对p53磷酸化的影响。结果发现，，p38 MAPK及其下游底物激活转录因子2(activator transcription factor-2，ATF-2)能被磷酸化激活，虽然SB203580的预处理对于p38 MAPK的磷酸化并没有抑制，但的确阻断了p38的激酶活性。同时观察到，UV也能刺激p53磷酸化，且SB203580的预处理并没有能够阻断p53的Ser~(15)磷酸化。这说明UV刺激时p53的磷酸化不是由p38MAPK介导，提示两者可能通过不同机制来介导UV刺激诱导的细胞反应。利用Western blot和免疫荧光染色验证了我们所使用的p38 MAPK基因敲除(gene knockout)小鼠胚胎成纤维细胞(murine embryonic fibroblast，MEF)p38~(-／-)细胞中p38 MAPK基因确实被成功敲除后，我们进一步观察了p38 MAPK基因敲除对UV诱导的p53磷酸化的影响。结果表明，在UV刺激时，表达p38的p38~(+／+)细胞和不表达p38的p38~(-／-)细胞中的p53都能显著地被磷酸化激活，说明p38 MAPK基因敲除对于UV刺激诱导的p53磷酸化并没有阻断效应，证实了在UV刺激时p38 MAPK确实不是介导p53 Ser~(15)磷酸化的主要激酶。观察到p38 MAPK基因敲除对于UV刺激诱导的p53磷酸化并没有阻断效应后，我们进一步研究了p38基因敲出的p38~(-／-)细胞中UV诱导的p53移位入核过程是否被阻断。结果表明，p38~(-／-)细胞中，未受刺激时p53的细胞内分布与p38~(+／+)细胞类似，而受到UV刺激后不但UV诱导的p53磷酸化没被阻断，而且其激活后的移位入核过程也未受影响。利用Western blot和免疫荧光染色验证了我们所使用的p53基因敲除的MEF细胞(p53~(-／-))中p53基因确实被成功敲除后，我们进一步观察了p53基因敲除对UV诱导的p38 MAPK磷酸化的影响。结果表明，在UV刺激时，p53~(+／+)细胞和p53~(-／-)细胞中的p38 MAPK都能较刺激前显著地被磷酸化激活，证实p53基因敲除对于UV刺激诱导的p38 MAPK的磷酸化也没有影响。观察到p53基因敲除对于UV刺激诱导的p38 MAPK磷酸化并没有阻断效应后，我们进一步研究了p53~(-／-)细胞中UV诱导的p38 MAPK移位入核过程是否被阻断。结果发现，未受刺激时p38 MAPK在p53~(-／-)细胞与p53~(+／+)细胞中的分布类似，而受到UV刺激后，在p53~(-／-)细胞UV诱导的p38 MAPK磷酸化并没被阻断，而且其激活后的移位入核过程也未受影响。我们进一步验证UV刺激是否诱导p38 MAPK与p53有物理学上的相互作用。利用基因共转染，进行免疫共沉淀(co-immunoprecipitation，Co-IP)实验，结果发现，无论受到UV刺激与否，两者都没有发生相互作用。我们随后研究了p53和p38 MAPK基因敲除对UV诱导的细胞凋亡的影响。我们首先利用荧光显微镜对于凋亡细胞进行了形态学上的观察。结果发现，在静息状态下，p38~(+／+)细胞的核染色均匀一致，而p38~(-／-)细胞有少数细胞已有核浓染的现象。UV刺激后，p38~(+／+)细胞核仍然表现为形态清楚，没有明显改变，而部分p38~(-／-)细胞产生了典型的凋亡细胞形态学变化，即胞质浓缩以及核浓染、边缘化和碎裂。在静息状态下，p53~(+／+)细胞和p53~(-／-)细胞的核染色都均匀一致。UV刺激时，p53~(+／+)细胞核仍然表现为形态清楚，没有明显改变，而部分p53~(-／-)细胞产生了典型细胞凋亡的形态学变化。这说明p38 MAPK和p53对于UV诱导的细胞凋亡都具有保护作用。在形态学上观察了p53或p38 MAPK基因敲除对UV诱导的细胞凋亡的影响后，我们通过流式细胞仪对细胞凋亡情况进行了定量分析。我们首先研究了p38 MAPK基因敲除对UV诱导的细胞凋亡的影响。结果表明，p38~(-／-)细胞刺激后的凋亡率与刺激前相比明显增加(P＜0.01)，与p38~(+／+)细胞刺激后的凋亡率相比也有明显增加(P＜0.01)。我们随后又研究了p53基因敲除对UV诱导的细胞凋亡的影响。结果表明，p53~(-／-)细胞刺激后的凋亡率与刺激前相比明显增加(P＜0.01)，与p53~(+／+)细胞刺激后的凋亡率相比也有明显增加(P＜0.01)。这说明p38 MAPK或p53基因敲除可使UV诱导的细胞凋亡数量增加。我们随后又观察了SB203580预处理对UV诱导的p53或p38 MAPK基因敲除细胞凋亡的影响。结果表明，在SB203580预处理时，p38~(+／+)细胞刺激后的凋亡率与刺激前相比明显增加(P＜0.01)，p38~(-／-)细胞刺激后的凋亡率与刺激前相比也有明显增加(P＜0.01)，但p38~(+／+)细胞与p38~(-／-)细胞之间刺激后的凋亡率没有明显差异。同时，p53~(+／+)细胞刺激后的凋亡率与刺激前相比明显增加(P＜0.05)，p53~(-／-)细胞刺激后的凋亡率与刺激前相比也有明显增加(P＜0.01)。而且，单独的SB203580预处理时，p53~(-／-)细胞的凋亡率较p53~(+／+)细胞明显增加(P＜0.05)；当SB203580预处理后，再使用UV刺激，p53~(-／-)细胞与p53~(+／+)细胞相比凋亡率也明显增加(P＜0.01)。上述结果提示单独的p38 MAPK基因敲除或p53基因敲除都使细胞在受到UV刺激时易于凋亡，而且两者的功能具有叠加效应，进一步证实在特定条件下两者对于细胞都具有保护作用。尽管p38 MAPK与p53都能对UV刺激诱导的细胞凋亡具有保护作用，但由于两者在激活的动力学过程、相互之间的激活、激活后的移位以及相互作用等方面都没有功能上的联系，因此应当是通过不同细胞信号机制来介导对细胞的保护作用。总之，本实验主要利用免疫印迹(immunoblotting)、免疫荧光染色(immuno-fluorescence staining)、核形态学(nuclear morphology)观察及流式细胞术(flow cytometry)等技术研究了p38 MAPK与p53在低剂量UV刺激时的激活、移位、相互作用以及凋亡之间的关系，并进一步探讨两者在UV诱导凋亡时对细胞保护作用的可能机制，得出了以下结论： 1．p38 MAPK与p53在UV刺激时激活的动力学过程具有不同的特点； 2．抑制p38 MAPK或其功能缺失对于UV诱导的p53磷酸化激活和激活后移位没有影响； 3．p53功能抑制对于UV诱导的p38 MAPK磷酸化激活和激活后移位没有影响； 4．p38 MAPK和p53对于UV刺激诱导的细胞凋亡都具有保护作用，且两者的作用具有叠加效应； 5．p38 MAPK和p53通过互不依赖的信号机制来介导对UV刺激诱导的细胞凋亡的保护作用。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：第一军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2007
【分类号】：R363

【引证文献】