LPS调节大鼠腹腔巨噬细胞表达CRH和UCN及其机制的研究
本文选题:巨噬细胞 + 促肾上腺皮质激素释放激素 ; 参考:《第三军医大学》2007年硕士论文
【摘要】: 研究背景与目的 促肾上腺皮质激素释放激素(corticotropin-releasing hormone,CRH)是下丘脑-垂体-肾上腺(hypothalamic-pituitary-adrenal,HPA)轴上游重要的神经激素和调节因子之一,通过调节垂体释放促肾上腺皮质激素(arenocorticotrophic hormone,ACTH)来控制糖皮质激素(glucocorticoid,GC)在肾上腺皮质的分泌。Urocortin(UCN)则是近年发现的CRH结构相关肽之一,它可与CRH受体家族的两个主要成员CRH-R1和CRH-R2结合来发挥生物学效应。研究发现,CRH和UCN与免疫系统关系密切,不仅可通过调控HPA轴上GC的释放来调节免疫炎症反应;还可通过免疫细胞表面的CRH受体,发挥直接的免疫调节效应。哺乳动物在正常生理及应激条件下外周血CRH和UCN浓度均较低,但是在炎症局部则存在较高水平的CRH和UCN。研究证实部分免疫细胞可表达CRH和UCN,其表达水平在细胞免疫激活后会显著上调。因此,目前普遍认为参与直接调节免疫细胞功能的外周CRH和UCN主要来源于炎症反应局部,通过自分泌和旁分泌方式发挥作用。巨噬细胞是炎症反应启动细胞之一,参与了细胞和体液免疫过程,是重要的杀微生物效应细胞,在感染等疾病的发生、发展过程中发挥着重要作用。内毒素(lipopolysaccharide,LPS)是革兰氏阴性菌细胞壁的主要成分,是革兰氏阴性菌感染时诱发炎症反应的主要物质之一;它可诱导巨噬细胞释放TNF-α等炎症介质,外源性CRH和UCN及其受体拮抗剂可显著影响LPS的该作用效应,并改变了内毒素血症小鼠的预后和转归;LPS也可引起巨噬细胞表面的TLR4上调,而外源性CRH及UCN增强了LPS的该作用效应。因此,CRH及UCN在LPS介导的巨噬细胞功能改变中发挥了重要作用;但是LPS作用于巨噬细胞后,内源性CRH和UCN在巨噬细胞的表达及其调控机制目前仍不清楚。 因此,本课题旨在探讨内毒素作用后巨噬细胞表达CRH和UCN的规律及其可能的表达调控通路。 材料与方法 本课题在体外分离培养健康、成年(230~270g)Wistar大鼠腹腔巨噬细胞的基础上,利用RT-PCR及ELISA技术进行以下几个方面的研究:(1)检测正常培养的大鼠腹腔巨噬细胞中CRH和UCN mRNA及多肽含量,了解CRH及UCN在正常巨噬细胞的表达水平;(2)用5ng/ml或25ng/ml佛波脂(TPA)处理培养的大鼠腹腔巨噬细胞,检测处理后1h、2h、4h、8h细胞中CRH及UCN mRNA及多肽含量变化,观察CRH及UCN在活化腹腔巨噬细胞的表达规律;(3)用10ng/ml或100ng/ml LPS处理培养的大鼠腹腔巨噬细胞,体外模拟内毒素血症条件,检测处理1h、2h、4h、8h时细胞中CRH及UCN mRNA及多肽含量变化,揭示内毒素作用下巨噬细胞表达CRH及UCN的变化规律;(4)在加入LPS前30min分别用不同浓度的特异性阻断剂预处理细胞阻断MAPK(mitogenactivatedprotein kinase,丝裂原活化蛋白激酶)信号通路中的关键激酶:10μmol/L、50μmol/L、100μmol/L PD98059阻断细胞外信号调节蛋白激酶(extracellular signalregulated kinase1/2,ERK1/2),10μmol/L、50μmol/L SB203580阻断c-Jun N端蛋白激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK),10μmol/L、50μmol/L SP600125阻断p38MAPK;再用100ng/ml LPS处理细胞。在LPS刺激细胞4h时,检测细胞中CRH mRNA及多肽含量变化,探讨MAPK信号通路在LPS调控巨噬细胞表达CRH中的作用。 主要结果 1.在正常体外培养的大鼠腹腔巨噬细胞中,转录一定水平的CRH及UCNmRNA(n=8);并合成一定水平的CRH及UCN多肽,胞溶部分CRH多肽约为0.07±0.01ng/10~7cells(n=6),UCN多肽约为1.0±0.50ng/10~7cells(n=6)。 2.TPA呈时间依赖性上调大鼠腹腔巨噬细胞中CRH及UCN的表达。CRH mRNA水平在TPA处理细胞8h时达峰值(p<0.01,n=8),约为对照组的2.1倍,不同剂量组间无显著差异;胞溶部分CRH多肽含量在25ng/ml TPA处理细胞8h时达峰值(p<0.01,n=6),约为对照组的2.0倍,为0.14±0.03 ng/10~7cells。UCN mRNA水平在TPA处理细胞4h时达峰值(p<0.01,n=8),约为对照组的2.1~2.3倍,不同剂量组间无显著差异;胞溶部分UCN多肽含量在25ng/ml TPA处理细胞8h时达峰值(p<0.01,n=6),约为对照组的7.1倍,为7.01±0.74 ng/10~7cells。 3.LPS呈时间依赖性上调大鼠腹腔巨噬细胞中CHR及UCN的表达。CRHmRNA在LPS处理4h时达峰值(p<0.01,n=8),约为对照组的1.9~2.1倍,不同剂量组间无显著差异;胞溶部分CRH多肽含量在浓度为100ng/ml的LPS处理2h时达峰值(p<0.01,n=6),约为0.30±0.07ng/10~7cells,在8h时CRH多肽含量仍保持在0.15±0.07ng/10~7cells,约为对照组的2.1倍。UCN mRNA在LPS处理4h时达峰值(p<0.01,n=8),约为对照组的1.8~2.0倍,不同剂量组间无显著差异;胞溶部分UCN多肽在100ng/mlLPS处理8h时达峰值(p<0.01,n=6),约为8.68±1.25ng/10~7cells。 4.ERK1/2特异性阻断剂PD98059呈剂量依赖性抑制LPS诱导的CRH表达上调,其最大抑制效应浓度为100μmol/L,抑制效率在mRNA水平达95%(n=8),在多肽水平达90%(n=6);c-JNK特异性阻断剂SB203580、p38MAPK特异性阻断剂SP600125也呈剂量依赖性抑制LPS诱导的CRH表达上调,其浓度为50μmol时抑制效应在mRNA水平分别达41%、49%。 结论 1.正常腹腔巨噬细胞有CRH及UCN表达,提示它们在维持正常巨噬细胞及其它免疫细胞功能中的潜在意义。 2.佛波脂促进了CRH及UCN在巨噬细胞的表达;在内毒素作用的巨噬细胞,CRH及UCN迅速上调并维持在较高水平,提示激活的巨噬细胞可能转录合成大量CRH和UCN,参与炎症局部的病理生理调节活动。 3.LPS上调CRH在腹腔巨噬细胞的表达主要依赖于MAPK信号通路,其中ERK1/2信号通路最为重要。 4.在正常及LPS刺激后的腹腔巨噬细胞,UCN的多肽含量均远高于CRH含量;并且UCN与CRH受体家族有更高的亲和力,我们推测UCN在免疫调节中可能较CRH更有意义。
[Abstract]:......
【学位授予单位】:第三军医大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2007
【分类号】:R363
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,本文编号:1938732
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