重组单纯疱疹病毒的溶瘤机制及其对非允许细胞NIH3T3感染的研究

发布时间：2018-06-03 18:11

  本文选题：重组单纯疱疹病毒 + 溶瘤机制　； 参考：《武汉大学》2006年博士论文

【摘要】： 我们曾经报道构建了一株大肠杆菌β-半乳糖苷酶(lacZ)基因插入凋亡抑制基因(神经毒基因)icp34.5位点使之失活的选择性复制的重组单纯疱疹病毒mtHSV,它能选择性地杀死肿瘤细胞,而不杀死正常细胞。mtHSV的这种选择性溶瘤效果,在多种肿瘤细胞系和瘤内注射的荷Hep3B的裸鼠模型上得到了证实,然而,它的溶瘤机制尚未确定。 Farassati F.等研究证明,HSV-1易感染转染了癌基因v-erbB、激活了sos或者ras基因的NIH3T3细胞。这意味着HSV-1通过Ras信号途径进入细胞。我们以前的研究表明RTN家族中的一个重要成员RTN3(RTN3即HAP,ASYIP, ASY的同源相互作用蛋白)是内质网应激反应的靶基因,过表达的RTN3能导致内质网超载反应。我们以前的研究也显示RTN3的一个重要特征是它定位在内质网上,但是关于RTN3与Ras的关系以及与mtHSV感染Hela细胞的关系尚未见报道。 在本研究中,我们着眼于研究mtHSV选择性溶瘤的分子机制,即mtHSV侵染Hela细胞与Ras和RTN3的关系。研究表明,HeLa细胞能被mtHSV有效杀死。流式细胞术和Western blot实验表明,mtHSV感染HeLa细胞48小时后,随着内质网中RTN3蛋白上调,细胞质膜上的Ras蛋白明显下调,而细胞中的Ras蛋白总量没有变化。用人法尼基转移酶的α亚基的siRNA抑制剂siFTa和RTN3的siRNA抑制剂siRTN3分别转染HeLa细胞48小时后,细胞质膜上的Ras蛋白和细胞中的Ras蛋白总量分别被下调,siFTa和siRTN3能有效地杀死HeLa细胞,有效地抑制mtHSV感染HeLa细胞。我们进一步用激光共聚焦和免疫共沉淀实验研究了Ras和RTN3的关系。研究结果表明:Ras和RTN3能在内质网上相互作用,Ras/RTN3是mtHSV侵染HeLa细胞的一个重要因素。Ras和RTN3分子间的相互作用进一步提升了我们对Ras和RTN3在mtHSV感染HeLa细胞过程中功能的理解。 为了进一步研究mtHSV侵染Hela细胞与P53以及细胞凋亡的关系,分别用流式细胞术和Western blot方法检测了P53蛋白的表达。结果表明:mtHSV感染Hela细胞后24h,P53蛋白的表达无明显变化。DNA ladder分析、Hoechst 33258染色观察、Annexin V/PI双染法检测表明:mtHSV不诱导Hela细胞早期凋亡。在Hela细胞中,p53基因序列正常,HPV-16被整合到Hela细胞中,P53蛋白功能失常,因此mtHSV不诱导Hela细胞早期凋亡。上述结果表明:mtHSV引起Hela细胞死亡与P53无关,mtHSV通过裂解细胞导致Hela细胞死亡。 为了进一发现mtHSV进入细胞的入口,以便透彻理解mtHSV侵染细胞的分子机制。用mtHSV去筛选噬菌体十五肽文库,经过四轮淘洗,筛选到一个特异性很强的十五肽片段。经推断出的氨基酸序列APFSRLLFPDFRSFV与RasGRP2具有84%的同源性。构建了重组质粒AcBacmid-RasGRP2和重组AcNPV vAc-RasGRP2,在昆虫Sf9细胞中表达了RasGRP2蛋白,表达的蛋白分子量约为68KD。生物软件"DAS"  Transmembrane Prediction server对RasGRP2蛋白的跨膜区预测结果表明:RasGRP2蛋白是跨膜蛋白,RasGRP2蛋白297-314处连续有18个疏水氨基酸(LGVHLKDLVALQLALPDW),为RasGRP2蛋白的跨膜区。 为了确定mtHSV的相互作用蛋白RasGRP2在mtHSV和HSV-1感染细胞过程中的作用,构建了能表达RasGRP2蛋白的真核表达载体pAdtrackCMV RasGRP2 ,以gfp作(绿色荧光蛋白)作为报道基因,以确定RasGRP2蛋白在细胞中的表达。用pAdtrackCMV RasGRP2转染mtHSV和HSV-1的非允许细胞系NIH3T3 48小时后,分别用mtHSV和HSV-1感染NIH3T3细胞。病毒吸附感染实验结果表明:表达RasGRP2蛋白的NIH3T3细胞可以被mtHSV和HSV-1感染。Stone JC等报道:RasGRP2位于Ras信号通路上且位于Ras的上游,我们关于mtHSV的相互作用蛋白RasGRP2介导mtHSV和HSV-1对非允许细胞NIH3T3感染的研究结果同时证明了,RasGRP2是mtHSV和HSV-1进入细胞的新的入口,Ras信号途径是mtHSV进入细胞的重要门户。上述研究结果将为mtHSV用于癌症治疗提供理论依据。
[Abstract]:We have reported that a recombinant herpes simplex virus mtHSV , which has been constructed , inserted into an apoptotic suppressor gene ( neurotoxic gene ) icp34 . 5 , has been constructed to selectively kill tumor cells without killing normal cells . This selective dissolving effect of mtHSV is confirmed on the nude mouse model of Hep3B injected in a variety of tumor cell lines and tumors , however , its tumor - dissolving mechanism has not yet been determined .






Farassati F . et al . have shown that HSV - 1 is susceptible to infection with the oncogene v - erbB , activating the cells of the cell line of sos or ras . This means that HSV - 1 is an important member of the RTN family that is the target gene of the endoplasmic reticulum stress response . Previous studies have shown that one of the important features of the RTN family is that it is located on the endoplasmic reticulum , but the relationship between RTN3 and Ras and the relationship with mtHSV - infected Hela cells has not yet been reported .






In this study , we focus on studying the molecular mechanism of mtHSV selective dissolving , that is , the relationship between Ras and RTN3 in HeLa cells infected by mtHSV . The expression of Ras protein and Ras protein in the cytoplasm of HeLa cells were downregulated by flow cytometry and Western blot . The results showed that Ras and RTN3 could effectively kill HeLa cells . The interaction between Ras / RTN3 and Ras / RTN3 was an important factor in the invasion of HeLa cells .






The expression of P53 protein was detected by flow cytometry and Western blot . The results showed that mtHSV did not induce the early apoptosis of Hela cells .






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本文编号：1973716