李氏溶血素单克隆抗体制备及检测李氏溶血素的初步探索

发布时间：2018-06-27 14:56

  本文选题：单核细胞增生性李斯特氏菌 + 李氏溶血素　； 参考：《东北农业大学》2007年硕士论文

【摘要】： 单核增生性李斯特杆菌(Listeria Monocytogenes，LMO)是一种重要的人畜共患食源性疾病致病菌，可引起人和动物的脑膜炎、败血症等疾病，病死率非常高。李氏溶血素(Listeriolysin O，LLO)由LMO分泌，是LMO特有的毒力因子，在其感染机体的过程中，发挥极为重要的作用。本实验以原核表达系统pGEX-6P-hly／BL-21表达的重组LLO，经纯化作为免疫抗原，免疫BALB／c小鼠，以LMO—0586于BHI培养基中分泌的天然LLO为筛选抗原，检测抗LLO单克隆抗体。经过细胞融合，建立间接ELISA方法，采用有限稀释法，经三次亚克隆，获得6株稳定分泌抗LLO单克隆抗体的杂交瘤细胞株，分别命名为ⅠF5、ⅡC4、ⅡE5、ⅢG7、ⅣB7、ⅣE9。 经亚类鉴定其中ⅠF5、ⅡC4、ⅣE9、ⅡE5分泌的单克隆抗体为IgG1型，ⅣB7、ⅢG7分泌的单克隆抗体类型为IgM型，所有都是κ链抗体；杂交瘤细胞染色体数目平均在85-103条；间接ELISA检测杂交瘤细胞培养上清抗体效价ⅠF5、ⅡC4为1：512，ⅣE9、ⅣB7、ⅢG7为1：256，ⅡE5细胞培养上清效价为1：128；以分泌性较好的ⅡC4细胞株大量制备腹水单抗，经检测其效价为1：10~5，Western blot检测该单克隆抗体具有很好的反应特异性；阻断ELISA检测溶血素实验发现此单抗对天然李氏溶血素有较好的结合能力，不与葡萄球菌、链球菌、丹毒杆菌所分泌的溶血素结合，说明所制备的抗重组LLO单克隆抗体对病原检测具有高度的特异性。 本研究还以纯化的重组LLO包被ELISA微量反应板，以制备的腹水单抗为诊断抗体，然后用此诊断抗体分别与BHI培养基和TSB-YE培养基培养的不同时段的LMO上清发生反应，初步在实验室建立了阻断ELISA检测LMO的方法。使用TSB-YE培养基，其检出时间和检菌限值分别为增菌后5h和9.5×10~5个／ml，使用BHI培养基其检测时间和检菌限值分别为增菌后5.5h和2.7×10~6个／ml，实验中还发现从不同培养基繁殖细菌效果看，相同的培养时间BHI培养基的增菌数要大于TSB-YE培养基，而从细菌产生LLO的能力上看，使用TSB-YE培养基要明显强于BHI培养基，可以更早的检出LMO，这为进一步研制LMO快速检测试剂盒奠定了基础。
[Abstract]:Listeria monocytogenes LMO (LMO) is an important zoonotic disease pathogen, which can cause meningitis, septicemia and other diseases in humans and animals, and the mortality is very high. Listeriolysin O LLO, secreted by LMO, is a unique virulence factor of LMO and plays an important role in the process of infection. In this experiment, recombinant LLOs expressed in prokaryotic expression system pGEX-6P-hlyhly- / BL-21 were purified as immune antigen to immunize BALB / c mice, and natural LLO secreted by LMO-0586 in BHI medium was used as screening antigen to detect anti-LLO monoclonal antibody. After cell fusion, an indirect Elisa method was established and six hybridoma cell lines stably secreting monoclonal antibodies against LLO were obtained by using limited dilution method and three subclones. The hybridomas were named 鈪，

本文编号：2074290