抗人血栓调节蛋白单克隆抗体的制备及初步应用研究

发布时间：2018-07-14 07:37

【摘要】：目的:建立稳定表达人血栓调节蛋白(hTM)的克隆细胞株,制备抗hTM单克隆抗体(McAb),为心血管疾病的研究提供基础。方法:(1) 重组表达质粒pThr402提纯后经lipofectamine脂质体转染CHO,经G418筛选,流式细胞术及Western blotting检测,获得稳定高表达hTM的克隆细胞株CHO-TM。(2) 采用CHO-TM细胞作为免疫原,免疫Balb/c雌性小鼠,按常规方法融合并经CELISA法筛选,制备稳定分泌抗人血栓调节蛋白MaAb的克隆细胞株,并对McAb的亚类、免疫活性、细胞与组织特异性及识别抗原特异性进行鉴定。(3) 收集动脉粥样硬化病人血标本,将抗人血栓调节蛋白McAb应用于Western blotting检测病人的sTM水平。结果:(1) 成功获得了稳定、高效表达hTM的克隆细胞株CHO-TM1、CHO-TM3～6。其中CHO-TM6的表达量最高,阳性细胞百分率与平均荧光强度分别为89.00%和9.84。(2) 成功制备了抗人血栓调节蛋白McAb,命名为NH-1。琼脂糖免疫双扩散法鉴定NH-1的重链为IgGl亚类。CELISA法测定其腹水效价为5×10~(-5),M750-B紫外分光光度仪测定腹水抗体含量为20mg/ml。流式细胞仪检测该抗体与CHO-TM6和HUVEC呈阳性反应,与CHO及正常人外周红细胞、白细胞、未活化血小板呈阴性反应。ABC免疫组织化学法检测正常人组织切片显示其该抗体除与子宫和前列腺有交叉反应外,与小肠、胸腺、脾、甲状腺、胆囊、卵巢、膀胱、肝脏、肾脏、胃等组织呈阴性反应,各组织中的血管内皮细胞均有hTM表达。Western blotting分析显示McAb NH-1可特异地识别还原条件下相对分子量为105KD左右的蛋白多肽。(3) McAb NH-1可用于Western blotting检测动脉粥样硬化病人的sTM水平。结论:(1) 获得了稳定、高效表达hTM的克隆细胞株CHO-TM1、CHO-TM3～6;(2) 制备了一株具有较高免疫活性和细胞、组织特异性的抗人血栓调节蛋白McAb NH-1,并成功用于动脉粥样硬化病人sTM水平的Western blotting检测。
[Abstract]:Aim: to establish a cloned cell line expressing human thrombomodulin (hTM) stably and to prepare monoclonal antibody (McAb) against human thrombomodulin (hTM). Methods: (1) Recombinant expression plasmid pThr402 was purified and transfected into Cho by lipofectamine liposome. By G418 screening, flow cytometry and Western blotting detection, the cloned cell line CHO-TM was obtained. (2) CHO-TM cells were used as immunogen to immunize Balb / c female mice. The cloned cell lines secreting stable anti-human thrombomodulin MaAb were prepared by conventional fusion method and screened by CELISA, and the subclasses of McAb and its immunological activity were also studied. Cell and tissue specificity and antigen recognition specificity were identified. (3) Blood samples from patients with atherosclerosis were collected and antithrombomodulin McAb was applied to detect the STM level in patients with atherosclerosis by Western blotting. Results: (1) the cloned cell line CHO-TM1 (CHO-TM1) with high expression of hTM was successfully obtained. The percentage of positive cells and the average fluorescence intensity of CHO-TM6 were 89.00% and 9.84% respectively. (2) the anti-human thrombomodulin McAbwas successfully prepared and named as NH-1. The heavy chain of NH-1 was identified as IgGl subclass by double agarose immunodiffusion. CELISA method was used to determine the ascites titer of 5 脳 10 ~ (-5) M750-B ultraviolet spectrophotometer. The ascites antibody content was 20 mg / ml. The antibody was detected to be positive with CHO-TM6 and HUVEC by flow cytometry, and with peripheral red blood cells and white blood cells from Cho and normal subjects. The negative reaction of unactivated platelets. ABC immunohistochemical assay showed that the antibody reacted with small intestine, thymus, spleen, thyroid, gallbladder, ovary, bladder, liver and kidney, except for the cross reaction with uterus and prostate, but also with small intestine, thymus, spleen, thyroid, gallbladder, ovary, bladder, liver and kidney. The stomach and other tissues showed negative reaction. Western blotting analysis showed that McAbs NH-1 could specifically identify protein peptides with a relative molecular weight of about 105 KD in the reduced condition. (3) McAb NH-1 could be used to detect STM levels in atherosclerotic patients by Western blotting. Conclusion: (1) the cloned cell line CHO-TM1 (CHO-TM1) with high expression of hTM was obtained, and (2) a clone cell line CHO-TM1 with high immunological activity and cells was prepared. Tissue specific anti-human thrombomodulin McAb NH-1 was successfully used to detect the level of STM in atherosclerotic patients by Western blotting.
【学位授予单位】：南华大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2005
【分类号】：R392.1

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