Alpha-黑素细胞刺激素调节T细胞活化的分子机制

发布时间：2018-08-19 11:10

【摘要】： Alpha-黑素细胞刺激素(alpha-melanocyte stimulating hormone,α-MSH)作为神经肽和神经内分泌激素在免疫调节中发挥重要的作用,为一有效的抗炎和免疫调节分子。α-MSH的受体有五种,命名为MC1~5R,都与G蛋白耦联,属于I型与G蛋白耦联受体家族,具有七次跨膜结构,MC1R、MC3R、MC5R参与免疫调节。MCRs具有高度同源性(42%-67%),为目前已知的最小的G蛋白耦联受体,功能性的耦联腺苷酸环化酶(AC)。α-MSH结合MCR后,激活G蛋白活化亚基Gs,Gs活化AC,AC催化ATP转化为cAMP,胞浆cAMP的升高激活蛋白激酶A(PKA),PKA可以通过磷酸化作用影响胞内信号的转导并发挥一系列的生物学效应。大量文献报道,胞浆cAMP水平的升高可抑制TCR介导的T细胞活化,因此cAMP发挥着重要的免疫调节功能。在T细胞活化过程中,T细胞与抗原提呈细胞(APC)的相互作用需要细胞表面分子的相互结合(TCR/CD3-MHC/Ag、CD28-CD80、LFA-1-ICAM-1等)以形成稳定、紧密的相互接触结构——免疫突触(immunological synapse, IS),并持续传递活化信号,有效免疫突触的形成是触发TCR信号的关键。脂筏为富含胆固醇和鞘磷脂的细胞膜结构微域,其主要功能是募集信号蛋白分子并提供信号分子在质膜发生相互作用的平台,富集一些有利于TCR信号发生的分子(TCR、CD3、LAT、ZAP-70、Lck等)的同时将一些分子排除于脂筏区域之外(比如CD45),以利于免疫突触的形成。在静息T淋巴细胞,脂筏均匀地分布于细胞膜。T细胞接受抗原刺激或表面分子被交联后,脂筏发生聚集,并负责募集与信号发生有关的信号蛋白到激发部位(尤其是在免疫突触形成过程中),触发有效的TCR信号并向胞内转导活化信号。在脂筏聚集和免疫突触形成过程中,膜上分子的移动依赖于细胞膜内胞浆细胞骨架肌动蛋白微丝的重排,从而有利于免疫突触的有效形成以及信号分子最大限度的接触和结合,进而产生有效的活化信号。由于已经明确α-MSH具有明显的抗炎和免疫调节作用,以及本实验室前期研究结果表明人外周血T淋巴细胞表达五型MCRs(MC1R～MC5R),α-MSH可以抑制丝裂原PHA刺激T淋巴细胞的引起的增殖,抑制核转录因子NF-AT的DNA结合活性,从而抑制IL-2的合成。鉴于以上的α-MSH的作用以及有关T细胞活化过程中脂筏、免疫突触这两个模型的最新研究进展,同时由于在免疫应答过程中,淋巴细胞的活化与否、活化的强度如何、尤其是T细胞的活化在适应性免疫应答产生过程中的关键作用,以及α-MSH尚未阐明的免疫调节功能的确切分子机制,因此本研究从特异性T细胞活化的关键启动步骤——脂筏聚集和免疫突触形成入手,通过研究α-MSH对T细胞脂筏的运动、细胞骨架蛋白的重排、相关信号转导分子的表达、细胞因子的分泌的影响,探讨α-MSH调节T细胞活化的机制,为进一步阐明神经内分泌免疫网络调节机制,以及研究α-MSH用于防治免疫应答介导的炎症性疾病,提供新的理论依据,也为筛选或设计抗炎和免疫抑制药物提供新的作用靶标。第一部分α-MSH对T淋巴细胞活化后表面分子表达以及细胞因子分泌的调节作用利用白血病T淋巴瘤Jurkat细胞株作为研究对象;采用ELISA方法对不同刺激因素活化的T淋巴细胞和/或α-MSH(10-7mol/L)处理的细胞培养物离心后的上清进行细胞因子IL-2、IL-4、IL-5、IL-10、TNF-α、IFN-γ?测定;FACS分析T淋巴细胞表面分子CD3、LFA-1、CD45、活化标志CD69等表达的变化。利用Ca~(2+)离子探针Fluo-3-AM检测T淋巴细胞游离Ca~(2+)的变化,Fluo-3-AM(5μM)与T淋巴细胞共孵育后,FACS连续分析在不同刺激因素(CD3/CD28 mAb 1μg/ml,PMA 50ng/ml,α-MSH 10-7mol/L)下胞内Ca~(2+)离子浓度的变化以及α-MSH对该变化的影响。利用Western Blotting技术对T淋巴细胞活化过程中的p38 MAPK和NF-κB信号转导途径进行分析。对于Th1类细胞因子的研究发现,PMA可以引起IL-2、IFN-γ、TNF-α分泌的显著升高(P0.05);PMA活化的T淋巴细胞的同时给予α-MSH处理,结果显示T淋巴细胞所分泌的IL-2、IFN-γ、TNF-α与PMA单独刺激作用相比有显著的降低(P0.01)。采用100 ng/ml浓度的SEB对Jurkat细胞进行刺激,同时给予α-MSH(10~(-7)mol/L)并作用12 h后,取上清进行细胞因子IL-2、IFN-γ和TNF-α测定。结果显示,SEB刺激的T淋巴细胞所分泌细胞因子IL-2、IFN-γ和TNF-α有显著的提高(P0.05);α-MSH对SEB活化的T淋巴细胞分泌细胞因子IL-2、IFN-γ和TNF-α有显著的抑制作用(P0.05)。CD3/CD28 mAb刺激Jurkat T淋巴细胞后,IL-2和IFN-γ的分泌有非常显著的升高(P0.01);α-MSH与CD3/CD28 mAb联合作用的Jurkat T淋巴细胞,IL-2和IFN-γ的分泌有明显的下降(P0.05)。对于Th2类细胞因子的研究发现,CD3/CD28 mAb活化的Jurkat T淋巴细胞, IL-4的分泌水平明显低于对照组;α-MSH联合CD3/CD28 mAb作用的Jurkat T淋巴细胞IL-4的分泌显著高于CD3/CD28 mAb的单独作用(P0.05)。细胞因子IL-5的分泌与未活化的Jurkat T细胞相比,未发现有明显的变化。α-MSH联合CD3/CD28 mAb作用的Jurkat T淋巴细胞IL-5的分泌显著高于CD3/CD28 mAb的单独作用(P0.05)。细胞因子IL-10的分泌与未活化的对照组相比略有升高。α-MSH联合CD3/CD28 mAb作用的Jurkat T淋巴细胞IL-10的分泌非常显著地低于CD3/CD28 mAb的单独作用(P0.01)。 PMA活化的Jurkat T细胞分泌IL-4的水平与未活化的对照组相比未发现有明显的变化;α-MSH联合PMA作用于Jurkat T细胞,与PMA单独作用组相比,IL-4的分泌有显著的升高(P0.05)。PMA活化的T细胞分泌IL-5水平有明显的降低;α-MSH与PMA的联合作用于Jurkat T细胞,IL-5的分泌显著高于PMA的单独作用(P0.05)。PMA活化的Jurkat T细胞分泌的IL-10非常显著地高于未活化的Jurkat T细胞。α-MSH与PMA的联合作用于Jurkat T细胞,IL-10的分泌非常明显的低于PMA的单独作用(P0.01)。 FACS分析发现,α-MSH可以下调Jurkat T细胞活化后SLP-76、CD3、LFA-1的表达,可以延缓T淋巴细胞活化标志CD69分子在PMA和CD3/CD28 mAb刺激下的表达。CD3/CD28 mAb活化的Jurkat T细胞在18h内表达CD45分子有所上升。同时经过分析发现,α-MSH与CD3/CD28 mAb联合作用Jurkat T细胞,CD45分子的表达明显高于CD3/CD28 mAb的单独作用。 CD3/CD28 mAb刺激Jurkat T细胞活化后,FACS分析发现,0~22h内,CD69分子的表达持续上升。α-MSH对CD3/CD28 mAb所活化的Jurkat T细胞表达CD69分子在2~22h有明显的抑制作用(P0.05),说明α-MSH对CD3/CD28mAb所引起的T细胞活化有抑制作用。PMA活化Jurkat T细胞后,CD69分子的表达持续上升,其中2~8h内上升幅度最快,于8h左右达到高峰,之后的8~32h内CD69分子一直维持在高表达水平。在7h未发现α-MSH对PMA引起的T细胞活化后CD69分子的表达存在抑制作用;在1~7h内发现α-MSH与PMA联合作用于T细胞,CD69分子表达水平高于PMA的单独作用,这与α-MSH对CD3/CD28 mAb刺激T细胞表达CD69分子的抑制现象正好相反,说明存在信号转导通路的不同机制。PHA刺激的Jurkat T细胞,在1、2、3h未发现CD69分子的表达有明显的变化,在7h有显著的上升,α-MSH对这种上调作用有明显的抑制作用。 T细胞受CD3/CD28 mAb刺激后,胞内Ca~(2+)迅速上升,130 sec左右达到高峰,随后逐渐下降,300 sec后接近于正常水平。α-MSH与CD3/CD28 mAb联合作用于T细胞,胞浆游离Ca~(2+)水平显著高于正常水平,持续维持一定浓度,并低于CD3/CD28 mAb的单独作用,没有峰值的出现。说明α-MSH能够抑制CD3/CD28 mAb所引起的T细胞胞浆游离Ca~(2+)的升高。 PMA的结构类似于DG,作用于T细胞后,可以模拟T细胞活化后引起的DG产生,从而引起胞浆游离Ca~(2+)迅速上升。本研究观察到,PMA作用于T细胞后,在几秒钟内,胞浆游离Ca~(2+)迅速上升,并且随着时间的延长,一直维持较高水平,在本研究所观察的300 sec内,未发现有明显下降的趋势。α-MSH联合PMA作用于T细胞,胞浆游离Ca~(2+)数秒内迅速升高,随后缓慢下降,50 sec后,胞浆游离Ca~(2+)水平开始低于PMA单独的作用,一直延续到本研究所观察到的300s还有缓慢下降的趋势,说明α-MSH能够抑制PMA所引起的T细胞胞浆游离Ca~(2+)水平的升高。 West Blotting分析发现,活化后的T细胞,在α-MSH作用下,胞浆NF-κB、p38MAPK的水平有所下降。第二部分α-MSH对T淋巴细胞活化后细胞膜脂筏含量以及脂筏募集信号分子的调节作用采用蔗糖密度梯度低温超速离心技术对T淋巴细胞脂筏进行分离并对不同密度的脂筏进行收集;利用三氯醋酸(TCA)蛋白沉淀方法对不同密度的脂筏内蛋白进行沉淀和纯化;利用Brad-Ford蛋白定量方法对不同脂筏组分蛋白进行定量分析;SDS-PAGE技术对脂筏内蛋白进行定性和半定量分析;利用FACS技术结合β-环糊精可去除脂筏内胆固醇成分的原理对脂筏内信号蛋白分子进行定量分析;利用脂筏特异性标志物GM1的荧光标记配体——霍乱肠毒素亚单位B(CT-B)作为示踪剂,在激光共聚焦显微镜下对脂筏的分布及聚集情况进行观察;采用荧光实时(Real-time)定量PCR技术对脂筏主要成分GM3分子合成酶的基因的转录水平进行定量分析。通过对脂筏分析的结果发现,α-MSH抑制脂筏内总蛋白的含量,抑制LAT、ZAP-70、Lck、Talin蛋白在脂筏内的分布和含量,降低了CD3、CD28分子在脂筏内的分布,减少了脂筏主要成分GM3、GM1的合成。α-MSH与CD3/CD28 mAb联合作用于Jurkat T淋巴细胞,可使脂筏的聚集程度明显下降。第三部分α-MSH对T淋巴细胞活化过程中与APC之间形成免疫突触的调节作用及其机制采用白血病B淋巴瘤Raji细胞株作为抗原提呈细胞(APC),以超抗原葡萄球菌肠毒素B(SEB)进行抗原负载,然后与T淋巴细胞进行结合以形成IS并作为研究对象;在α-MSH处理因素下,利用荧光标记的细胞膜表面特定抗原的抗体和细胞荧光示踪染料标记细胞,在激光共聚焦显微镜下观察免疫突触的形成以及数目、脂筏和不同分子的分布情况等。利用FACS技术分析T淋巴细胞活化及免疫突触的形成以及该过程中细胞骨架肌动蛋白微丝的聚集情况;分析细胞骨架相关蛋白(ERM、Vav、EBP50、Talin、CDC42等)表达的变化以及磷酸化和去磷酸化程度。通过激光共聚焦显微镜下观察,发现α-MSH降低了免疫突触的形成数目,抑制了脂筏的聚集,降低了CD3分子的帽化程度,抑制了T细胞细胞骨架肌动蛋白微丝在细胞活化后的聚集程度。经随机视野对CD3帽化数目计数发现,PMA活化24h后的Jurkat T细胞与APCs之间形成IS时,CD3分子帽化比率明显高于正常非处理对照组(P0.01, n=4)。同时经α-MSH和PMA作用过的Jurkat T细胞与APCs之间形成IS时,CD3帽化数目明显降低(P0.05, n=4)。 FACS分析发现,未经处理的Jurkat T细胞与Raji B细胞之间形成IS的细胞数,在混合细胞中所占比率为5.16%;CD3/CD28 mAb活化24h后的Jurkat T细胞与Raji B细胞之间所形成IS的细胞数,占所有细胞的比率为18.02%;活化抗体联合α-MSH作用的Jurkat T细胞与Raji B细胞之间所形成IS的细胞数,占所有细胞比率的12.30%,说明α-MSH可以抑制活化的T细胞与APCs之间形成IS的能力。 T细胞活化后,可引起细胞骨架肌动蛋白的聚集,从而引起T细胞功能和形态的变化。微丝肌动蛋白染色后,聚集的微丝肌动蛋白的荧光强度明显升高。FACS分析发现,CD3/CD28 mAb活化的Jurkat T细胞在10 min时检测到最大的荧光强度,而用α-MSH作用20 min后,开始对F-actin的聚集程度有所抑制,到40 min时基本恢复到静息状态水平。此研究结果提示,α-MSH可以抑制由CD3/CD28 mAb所引起的T细胞细胞骨架微丝肌动蛋白的极化。 Talin是一种重要的细胞骨架肌动蛋白结合蛋白,一端与细胞膜整合素结合,一端与肌动蛋白结合。外界配体结合胞膜整合素受体后,可以引起Talin的构型变化。Talin可以与PIP2生成酶PIPKIγ-90(phosphatedylino- sitol phosphate kinase type Iγ-90)的剪接变体结合并使它激活,因此Talin可以刺激PIP2的生成,PIP2的生成反过来又可以增强Talin与整合素蛋白的相互作用,从而传递信号到细胞内部,引起细胞骨架肌动蛋白的聚集。本研究发现CD3/CD28 mAb活化的Jurkat T细胞在2h开始Talin表达升高;同时α-MSH与CD3/CD28 mAb联合作用于Jurkat T细胞,发现Talin的表达有所下降,说明α-MSH在TCR活化信号途径中,有下调Talin蛋白表达的作用。鉴于Talin在整合素(比如LFA-1等)信号转导中的重要作用,因此推论,α-MSH可以通过抑制Talin蛋白的表达而影响T细胞活化过程中由整合素所传递的信号。PMA活化的Jurkat T细胞表达Talin蛋白未发现有变化,而α-MSH与PMA联合作用于Jurkat T细胞,发现Talin蛋白的表达有所升高。由于PMA所活化的T细胞不涉及整合素家族信号转导途径,因此Talin蛋白在PMA活化的T细胞信号通路中的作用机制尚不明确。细胞形态的维持,以及细胞膜结构与表面张力的形成依赖于与细胞膜交联的胞浆细胞骨架,而联系细胞膜(包括脂筏)与细胞骨架的接头蛋白为埃兹蛋白、根蛋白和膜突蛋白(ezrin-radixin-moesin, ERM)蛋白家族系统。该家族蛋白以自身首尾折叠的形式处于非活化封闭构象状态,ezrin的氨基端FERM结构域可以结合细胞膜上的CD43、CD44、ICAMs-1/2/3、PSGL-1,而羧基端可以与肌动蛋白结合。ERM蛋白在细胞骨架运动过程中发挥重要的作用,T淋巴细胞通过TCR接受外来刺激信号后,引起ERM蛋白的磷酸化。识别抗原后,T淋巴细胞内ERM蛋白通过Vav1-Rac1途径去磷酸化而失活。同时也证实,ERM蛋白的去磷酸化有利于细胞骨架肌动蛋白从细胞膜的锚着部位脱离,提高了膜的柔韧性,从而有利于T-APC之间免疫突触的形成。研究发现,CD3/CD28 mAb活化Jurkat T细胞后,未发现ERM蛋白表达的变化,也未发现α-MSH对ERM蛋白表达有明显的影响。PMA活化的Jurkat T细胞在10h时ERM蛋白的表达有一定升高,α-MSH对这种上调有一定的抑制作用。通过对ERM蛋白磷酸化水平的分析发现,在1h时,α-MSH与CD3/CD28 mAb联合作用的ERM蛋白的磷酸化水平高于CD3/CD28 mAb的单独作用。 EBP50(ERM binding phosphoprotein 50)为连接脂筏和细胞骨架的接头蛋白,通过其PDZ结构域与Cbp(Csk binding protein)结合,其C末端与ERM蛋白结合,从而将Cbp与ERM蛋白连接起来,调控肌动蛋白对脂筏的聚集作用。T细胞活化后,Cbp/PAG(Csk相关的膜接头蛋白)被募集于脂筏内, Cbp的高表达可以降低膜的柔韧性,从而抑制IS的形成,EBP50突变体可以恢复IS的形成以及T细胞的活化。说明EBP50在膜的运动性以及T细胞活化、IS形成中发挥重要的负性调控作用。本研究发现CD3/CD28 mAb活化Jurkat T细胞后12h内,未发现EBP50表达的变化,而α-MSH联合CD3/CD28 mAb作用于Jurkat T细胞,发现EBP50的表达的下降。PMA活化的Jurkat T细胞,在10h时发现EBP50有所下降;α-MSH和PMA的联合作用,在1h时发现EBP50水平高于PMA的单独作用。 Cdc42为Rho家族的小分子鸟苷酸三磷酸酶成员,通过构象改变来实现活化(GTP结合)和去活化(GDP结合)状态,这种转换是受鸟苷酸转换因子GEFs(如Vav)等的调节。Vav1活化的Cdc42与WASP蛋白结合,使WASP移位于细胞膜附近并打开其活化的开放结构,活化的WASP与Arp3/2发生作用,进而引起肌动蛋白的多聚化。本研究发现CD3/CD28 mAb活化的Jurkat T细胞在10~12h时Cdc42表达升高,而α-MSH与CD3/CD28 mAb的联合作用发现Cdc42表达水平降低。PMA或CD3/CD28 mAb活化的T细胞12h内未见Vav蛋白表达的变化;而α-MSH与PMA或CD3/CD28 mAb的联合作用2h后发现,Vav蛋白水平低于PMA或CD3/CD28 mAb的单独作用下的Vav水平。通过对Vav蛋白磷酸化水平的分析发现,在60min内,α-MSH与PMA或CD3/CD28 mAb的联合作用Vav蛋白的磷酸化水平明显低于PMA或CD3/CD28 mAb的单独作用。结论 α-MSH可以抑制T淋巴细胞分泌Th1细胞因子IL-2、TNF-α和IFN-γ,促进T淋巴细胞产生Th2细胞因子IL-4、IL-5。α-MSH降低了T细胞活化后CD69、CD28、LFA-1、SLP-76等的表达,降低了胞浆游离Ca2+的浓度以及NF-κB和p38MAPK的水平。α-MSH能降低活化的T淋巴细胞与APCs形成IS的能力,降低活化后细胞骨架肌动蛋白微丝的聚集程度。α-MSH可以改变T淋巴细胞活化过程中脂筏的合成和聚集,降低了信号分子或接头蛋白(Lck、LAT、CD3、CD28、ZAP-70)在脂筏内的含量,从而阻碍TCR信号发生平台的产生,进而抑制T淋巴细胞的活化。本课题组前期研究结果证实了α-MSH可以对由Th1反应所引起的实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)产生保护作用、对小鼠心脏移植排斥反应具有抑制作用,可以延长移植物的存活时间。本课题从分子水平部分阐明了α-MSH抑制T细胞活化的机制,进而丰富了α-MSH的抗炎作用机制,也为α-MSH的拟肽药物应用于治疗免疫应答介导的炎症疾病提供了理论基础。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2007
【分类号】：R392

【共引文献】