【摘要】： 第一部分运用基因芯片技术研究hALR的免疫调控作用的分子机制 目的:肝再生增强因子(Augmenter of liver regeneration, ALR)是一种非特异性、具有热稳定性、不同于以往已知的促肝细胞增殖的肝细胞再生因子。因为它不仅通过直接刺激肝细胞增殖,而且可能还通过免疫调控作用参与损伤肝脏的修复。我们的前期研究已证明,ALR在体外能以剂量依赖方式抑制ConA刺激的大鼠T淋巴细胞增殖作用,并能抑制APC递呈的特异性抗原刺激的T淋巴细胞的增殖,减少IL-2分泌。但目前对于ALR在免疫调节方面的分子作用机理还不十分明确。本实验拟利用基因芯片这一高通量技术,全面分析在hALR作用下ConA诱导的淋巴细胞与单纯经ConA刺激的淋巴细胞的基因表达谱的差异,对所有表达的基因进行生物信息学分析,汇总整理出与hALR对ConA诱导的淋巴细胞增殖抑制作用相关的重要基因、分子功能和信号通路,为进一步阐明ALR免疫调控作用的分子机制奠定基础。 方法: 1.hALR的原核表达、纯化及活性鉴定:复苏含有pQE30-hALR的原核表达质粒的大肠杆菌SG13009,在异丙基-硫代-β-D-半乳糖苷(isopropyl-1-thio-β- D-galactoside, IPTG)诱导下进行表达,产物经15% SDS-PAGE鉴定;用镍离子亲合层析柱(Ni-nitrilotriacetic acid resin, Ni-NTA )对表达产物hALR蛋白进行纯化,用15% SDS-PAGE鉴定。3H-TdR掺入法检测hALR生物学活性。 2采集正常人外周静脉血,分离人血单个核细胞(PBMC),并提取PBMC的总RNA。 3应用Affymetrix公司的人类HG-U133A plus 2.0芯片分别对hALR刺激下ConA诱导的淋巴细胞和单纯经ConA诱导的淋巴细胞基因表达谱进行全面分析。 4用RT-PCR方法对基因芯片检测结果进行验证。 5应用Microsoft Excel、GCOS(数据处理软件)等软件和相关网站对基因表达谱进行差异分析,并进行差异表达基因的Gene Ontology分类以及差异基因的Pathway分析 结果: 1、hALR在宿主菌SG13009中得到高效表达,表达产物分子量约为16KD,该蛋白经亲合层析纯化后经SDS-PAGE鉴定为单一条带。3H-TdR掺入法检测证实该蛋白能以剂量依赖方式刺激人肝癌细胞株QGY增殖。 2、对两张基因芯片进行差异分析后发现:当定义log2Ratio"g1时,上调基因有1422个,log2Ratio"f-1下调基因有1053个;log2Ratio"g2时,上调基因有257个,log2Ratio"f-2时下调基因有170个。 3、分别选择上调基因SMAD3与下调基因B4GALT1经半定量RT-PCR证实与基因芯片结果一致。 4、选择500个上调及500个下调的基因进行Pathway分析,这1000个基因参与了131个信号通路,如经典的MAPK signaling pathway、JAK-STAT signaling pathway,Wnt signaling pathway, Apoptosis signaling pathway等。 结论 1、成功纯化了原核表达的hALR蛋白,并对其进行了生物学活性鉴定。 2、成功完成了hALR刺激下ConA诱导的淋巴细胞与单纯ConA诱导的淋巴细胞基因表达谱差异分析。 3、经pathway分析表明:参与的信号通路主要与增殖、生长、细胞凋亡等有关。主要的基因有Tp53,IL-1A, FAS,JunD, Bcl2, TNFRSF10A, MAP3K2等,这些基因也大多参与细胞信号转导的功能。 4、基因芯片表达谱差异分析为信号通路中的相关基因和与之相联系的基因进行研究提供了可靠的依据。 第二部分MAPK信号通路与hALR抑制ConA诱导的T细胞增殖作用的关系 目的:前面的基因表达谱的差异分析研究提示:hALR对ConA诱导淋巴细胞增殖的抑制作用涉及到MAPK signaling pathway等多个信号通路途径,MAPK信号转导途径是细胞外信号引起细胞核内反应的通道之一,可参与细胞的形成、运动、凋亡、分化及生长增殖等多种生理过程,本实验旨在探讨MAPK signaling pathway在hALR对ConA诱导的淋巴细胞增殖抑制作用这一生物学过程中的作用。而基因表达调控的关键步骤在于转录起始部位,其中转录因子对众多基因的表达起着极为重要的调控作用,是连接信号转导与基因表达的桥梁,本实验选择了与MAPK信号通路相关的三个重要转录因子AP-1,NFAT,SRE,分别运用分泌型碱性磷酸酶报告基因瞬时转染技术,研究这些与MAPK信号转导途径密切相关转录因子对hALR的反应,了解hALR对ConA诱导淋巴细胞增殖的抑制作用的作用机制。并用western blotting免疫印迹法对有显著变化的转录因子上游磷酸化激酶的表达进行验证,以进一步明确hALR的免疫调控机制。 方法: 1.hALR对ConA诱导的Jurkat T细胞作用的研究:选择生长状态良好的JurkatT细胞,给予ConA刺激,并于刺激后6h给予不同浓度的hALR,以3H-TdR掺入法检测JurkatT细胞的增殖情况。 2.分泌型碱性磷酸酶(SEAP)报告质粒扩增,,酶切鉴定:分别将启动子上游含有AP-1,NFAT,SRE的反应元件)的分泌型碱性磷酸酶(SEAP)报告质粒转入JM109大肠杆菌进行质粒扩增,并小量抽提质粒,进行酶切鉴定。 3.分泌型碱性磷酸酶报告基因载体瞬时转染及分泌型碱性磷酸酶的检测:分别用GeneJuice脂质体将pAP1-SEAP、pNFAT-SEAP、pSRE-SEAP、pTAL-SEAP(阴性对照质粒),pSEAP2-control(阳性对照质粒)瞬时转染JurkatT细胞,转染后24h给予ConA刺激,转染后30h给予hALR;分别于给予hALR后0h、6h、18h吸取上清液,运用分泌型碱性磷酸酶检测试剂盒进行检测,以测定相应转录因子的转录活性。 4.Western印迹法检测AP1上游的关键激酶-磷酸化c-jun氨基端激酶(p-JNK)的表达:选择生长良好的JurkatT细胞,给予ConA刺激,并于刺激后6h给予hALR;加入hALR后0h,6h,12h分别取细胞液,提取细胞总蛋白,经蛋白定量后用Western印迹法检测c-jun氨基端激酶(p-JNK)的表达。 结果: hALR对ConA诱导的淋巴细胞增殖在20ul-100ul/ml浓度范围内有明显抑制作用,且呈剂量依赖关系。 分泌型碱性磷酸酶(SEAP)报告质粒经扩增后酶切鉴定结果与预期相符。 瞬时转染分泌型碱性磷酸酶报告基因载体后,碱性磷酸酶的检测结果提示:ConA刺激可使转录因子AP-1,NFAT,SRE转录活性均增高(P0.01);给予hALR刺激后,实验组(ConA+hALR)与对照组(ConA)比较,仅AP-1转录活性在刺激后6h和18h均有增高(P0.01),而NFAT和SRE的转录活性均无显著性差异(P0.05)。 Western印迹检测AP1上游的关键激酶-磷酸化c-jun氨基端激酶(p-JNK)的表达结果显示:单纯在ConA刺激下,细胞均呈现明显的p-JNK活性(P0.01));在hALR刺激下,ConA诱导的JurkatT细胞中p-JNK的表达水平在6h与12h,较单纯ConA刺激组有明显升高(p0.01);说明在hALR刺激下,p-JNK有过度表达。 结论: 验证了hALR抑制ConA诱导的JurkatT淋巴细胞增殖作用,并确定了hALR对JurkatT细胞作用的最适浓度。 对分泌型碱性磷酸酶(SEAP)报告质粒进行了扩增及酶切鉴定,为实验提供了质量可靠的质粒。 hALR的刺激可使ConA诱导的JurkatT细胞中,磷酸化c-jun氨基端激酶(p-JNK)发生过度表达,进一步使其下游的转录因子AP-1转录活性增高。提示:hALR对ConA诱导的淋巴细胞增殖抑制作用可能与JNK/MAPK信号通路的过度激活引起细胞发生凋亡有密切关系。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2007
【分类号】：R392
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本文编号：
2280268
