【摘要】： 阿尔茨海默病(Alzheimer disease，AD)的两大主要神经病理学特征之一是大量形成以过度磷酸化的微管相关蛋白tau为主要成分的神经原纤维缠结(neurofibrillary tangles，NFTs)。AD患者脑中异常过度磷酸化的tau的聚积是导致神经元功能受损的重要原因，但其机制尚不清楚。体外研究发现从AD患者脑中提取的由过度磷酸化的tau形成的双螺旋丝结构(PHF)中，tau蛋白不仅被磷酸化，还被泛素化，而后者是被蛋白酶小体降解的重要信号。进一步研究发现：AD患者脑中蛋白酶小体的活性是降低的，且PHF在体外可直接抑制蛋白酶小体的活性，但tau蛋白磷酸化和蛋白酶小体抑制之间的关系尚不清楚。本研究的主要目的是探讨蛋白酶小体活性抑制对tau蛋白磷酸化的影响以及磷酸化tau蛋白对蛋白酶小体活性的调节及其可能机制，并获得如下主要研究结果： 1．抑制蛋白酶小体导致HEK293／tau441细胞中总tau蛋白含量增加 用不同浓度的lactacystin(2.5μM，5μM，10μM)作用细胞后，用荧光底物Boc-Leu-Ser-Thr-Arg-AMC检测蛋白酶小体胰蛋白酶样的活性，结果发现蛋白酶小体的的活性被lactacystin呈剂量依赖性抑制，其抑制程度分别为对照组的58％、28％、11％。同时，用识别总tau的单克隆抗体Tau-5、多克隆抗体R134d进行免疫印迹检测细胞中的总tau蛋白的含量，结果显示：随着lactacystin(2.5μM，5μM，10μM)诱导的蛋白酶小体活性的下降，细胞内总tau蛋白的含量增加，为了排除这种结果是由于蛋白合成增加而不是降解减少而产生的，我们用放线菌酮抑制了蛋白的翻译过程，也获得相同的结果，说明tau蛋白可能是被蛋白酶小体降解的，是蛋白酶小体的降解底物。 2．抑制蛋白酶小体导致HEK293／tau441细胞中磷酸化tau蛋白含量增加 同样用lactacystin抑制细胞蛋白酶小体的活性，用识别非磷酸化Ser198／199／202位点的Tau-1以及识别磷酸化Ser396／404位点的PHF-1识别磷酸化Ser262位点的PS262识别磷酸化Thr231位点的PT231进行免疫印迹检测细胞中的tau蛋白的磷酸化，结果显示：与对照组细胞相比，lactacystin加药组细胞中Tau-1、PS262、PHF-1、PT231的免疫反应均明显增加，说明蛋白酶小体活性抑制可以导致细胞内tau蛋白的聚积，，包括磷酸化的tau和非磷酸化的tau蛋白，但由于总tau蛋白含量也有改变，经过与总tau蛋白的对比后发现PS262、PHF-1、PT231的免疫反应还是明显增加，而Tau-1的免疫反应减弱，表明蛋白酶小体一方面可以通过减少tau蛋白的降解来增加磷酸化和非磷酸化的tau，另一方面可能通过其他的机制来促进tau蛋白的磷酸化，而且在tau—1位点这种磷酸化的作用要强于蛋白酶小体的抑制导致的聚积，从而表现出了tau—1位点的磷酸化增强。 3．抑制蛋白酶小体导致HEK293／tau441细胞中GSK-3活性增高 由于lactacystin诱导的tau磷酸化位点大部分都是GSK-3的磷酸化位点，GSK-3是磷酸化tau蛋白的关键性蛋白激酶，其中9位丝氨酸是GSK-3β活性调节的磷酸化位点，通过免疫印迹检测GSK-3β总量及9位磷酸化位点的表达发现：9位磷酸化位点表达下降，GSK-3β总量也略有减少，结果提示GSK-3β的活性升高，我们进一步通过γ-~(32)P放射性同位素检测了GSK-3的活性，结果显示GSK-3的活性升高，为了进一步探讨GSK-3在lactacystin诱导的tau的磷酸化中的作用，我们用LiCl抑制GSK-3的活性，发现LiCl可以在PHF-1和Thr231位点部分恢复lactacystin所诱导的tau的磷酸化，更加说明了GSK-3在lactacystin诱导的tau的磷酸化中的作用。 4．抑制蛋白酶小体导致HEK293／tau441细胞中PP-2A活性降低及其机制 PP-2A是调节tau蛋白磷酸化的关键的磷酸酯酶，通过γ~(32)P放射性同位素检测了PP-2A的活性，发现PP-2A活性下降。 为了阐明蛋白酶小体抑制后是通过什么途径来调节PP-2A的活性的，我们用lactacystin抑制蛋白酶小体的活性，并检测PP-2A抑制剂1的表达，结果发现了PP-2A抑制剂1的表达明显增加，这说明PP-2A抑制剂1也可能是通过蛋白酶小体来降解的，蛋白酶小体的活性下降导致了PP-2A抑制剂1表达增加，同时PP-2A抑制剂1作用于PP-2A引起了PP-2A的活性下降。 上述结果证明了抑制蛋白酶小体活性可导致细胞内tau蛋白聚积及其可能的机制。为了进一步研究tau的磷酸化对蛋白酶小体活性的影响，我们将人最长tau异构体(tau441)稳定转染到HEK293细胞内，用不同浓度的蛋白激酶A(PKA)的激活剂Forskolin处理细胞，诱导细胞内tau蛋白过度磷酸化，研究tau蛋白磷酸化对蛋白酶小体活性的影响。结果如下： 1．Forskolin诱导tau蛋白的过度磷酸化 我们首先用蛋白激酶PKA的激活剂forskolin作用于转tau的HEK293细胞，并观察细胞内tau蛋白磷酸化状态。通过Western blot对tau蛋白的不同磷酸化位点(PS262，PHF-1，Tau-1，PS262)检测发现：细胞内的tau蛋白随forskolin(0.5μM，1μM，2μM，4μM)剂量增加而磷酸化的水平也增高，而细胞内的总tau蛋白的量没有明显改变。 2．Forskolin诱导tau蛋白聚积 tau蛋白的过度磷酸化可能是导致其在HEK293／tau441细胞内形成聚积体的原因。为了验证这一想法，我们同时做了tau蛋白PS214位点的免疫荧光及thioflavin-S染色。结果发现：在对照组细胞内，PS214的染色弱，thioflavin-S染色阳性的比率也小于5％。当用2gM forskolin处理细胞后，PS214的染色明显增加，thioflavin-S染色阳性的比率也有所增加(＞20％)，只是增加的程度远没有磷酸化的程度强。叠加后显示thioflavin-S染色阳性沉积远小于磷酸化的tau染色。用4μM forskolin处理HEK293／tau441发现PS214染色和21μM forskolin比仅有少许增加，而thioflavin-S阳性聚积体的形成则异常明显(＞60％)。叠加后显示出thioflavin-S染色阳性沉积和磷酸化的tau染色共定位于细胞内，提示磷酸化的tau蛋白在细胞内形成了广泛的聚积体。 3．tau蛋白的磷酸化对蛋白酶小体的活性具有双向调节作用 为了检测tau蛋白的磷酸化水平对蛋白酶小体活性的影响，我们用Forskolin诱导tau的磷酸化，用荧光底物Boc-Leu-Ser-Thr-Arg-AMC检测蛋白酶小体胰蛋白酶样的活性，结果显示较低程度的tau磷酸化可激活蛋白酶小体，而当tau的磷酸化升高到一定程度时，则可明显抑制其活性。该结果提示蛋白酶小体功能的抑制在AD的病变过程中可能是一个较晚的过程，可继发于tau的异常过度磷酸化。 根据上述研究结果，我们得出如下结论：lactacystin抑制蛋白酶小体活性可导致细胞内tau蛋白含量增高；GSK-3的激活和PP-2A的抑制参与了磷酸化tau蛋白的聚积，且PP-2A活性的下调与PP-2A抑制剂1含量升高有关；一定程度过度磷酸化的tau蛋白呈双向性调节(激活或抑制)蛋白酶小体活性。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2006
【分类号】：R363
【共引文献】
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