内皮细胞表达SSeCKS功能的初步研究

发布时间：2018-11-09 08:59

【摘要】： 【研究背景及目的】 Src抑制的蛋白激酶C的底物(Src Suppressed C Kinase Substrates，SSeCKS)是1995年发现的细胞支架蛋白，属于蛋白激酶A锚定蛋白超家族(A Kinase Anchoring Protein，AKAP)中的成员。SSeCKS的分子量为280／290kD，其氨基端有膜定位序列和蛋白激酶C(Protein Kinase C，PKC)结合位点，羧基端有蛋白激酶A(Protein Kinase A，PKA)结合位点。SSeCKS广泛表达于平滑肌细胞、肾小球系膜细胞、星形胶质细胞、成纤维细胞和血管的内皮细胞(Endothelial Cell，EC)等。对SSeCKS功能研究发现：SSeCKS通过锚定细胞周期蛋白D1(CyclinD1)控制G1／S期进程而调节有丝分裂；通过锚定PKC而参与肌动蛋白为基础的细胞骨架的调节。对SSeCKS分子表达与疾病相关性的研究发现：内毒素血症模型中脾脏、肝脏、淋巴结的EC中SSeCKS表达上调。 为进一步明确EC中SSeCKS所参与的生物学功能，及炎症刺激EC SSeCKS表达上调的意义，本课题首先研究了SSeCKS与EC增殖、粘附和迁移的关系；其次研究了SSeCKS与炎症的相关性；最后研究了SSeCKS与炎症刺激EC骨架结构改变的关系。 本研究在初步分析SSeCKS参与EC有关功能的基础上，发现SSeCKS参与炎症刺激后EC骨架结构的改变，并对其作用机制进行了初步探讨。本课题的开展可能为临床上认识脓毒血症等炎症引起血管通透性增加的机理及治疗提供新的思路。 【方法】 (1)用纤维连接蛋白(Fibronectin，FN)包被六孔板，通过免疫印迹(Western blotting)检测SSeCKS在EC黏附过程中的表达情况，免疫荧光法检测SSeCKS在EC迁移过程中的定位情况，流式细胞仪分析EC细胞周期，并检测相应细胞周期中SSeCKS的表达情况。 (2)应用BALB／c小鼠腹腔注射脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)建立内毒素血症模型，分别在1mg／kg、5mg／kg、10mg／kg、15mg／kg LPS腹腔注射后8h处死小鼠取肺组织，或在5mg／kg LPS腹腔注射后0、1、3、8、12、24h处死小鼠取肺组织。苏木素伊红(Hematoxylin and eosin，HE)染色观察小鼠肺组织病理学改变情况；实时定量PCR(Real Time-PCR)检测肺组织SSeCKS在mRNA水平的表达；原位杂交检测SSeCKS mRNA在肺组织中的定位情况；Western blotting检测肺组织SSeCKS在蛋白质水平的表达变化；免疫荧光双标法观察肺组织SSeCKS的细胞定位。 (3)分别应用LPS、肿瘤坏死因子(Tumor necrosis factorα，TNF-α)、白细胞介素-1β(Interleukin-1β，IL-1β)刺激大鼠肺微血管内皮细胞(Rat Pulmonary Microvessel Endothelial Cell，RPMVEC)及人脐静脉内皮细胞株ECV304，并根据刺激时间和刺激剂量的不同分批收集细胞。Real time-PCR法检测SSeCKS mRNA水平的表达情况；原位杂交法检测SSeCKS mRNA在细胞中的定位；Western blotting检测SSeCKS蛋白质水平的表达变化；免疫荧光法检测SSeCKS在细胞中的定位情况和F-actin的改变情况。构建SSeCKS siRNA干扰质粒，并应用SSeCKS siRNA干扰质粒封闭内源性SSeCKS的表达；Western blotting检测SSeCKS siRNA对ERK信号通路的影响；免疫荧光检测SSeCKS siRNA对细胞骨架的影响。 实验结果以(?)±s表示，用STAT 8．0软件进行One-Way-ANOVA分析，两两比较采用Student-Newman-Keuls(S-N-K)检验。以P＜0.05表示差异具有统计学意义。 【结果】 (1)FN能够显著诱导EC粘附和迁移，SSeCKS的表达量也随之增加，具有时间和剂量依赖性关系，且SSeCKS在细胞层状伪足聚集；经PKC抑制剂(Ro31-8220、Calphostin C)处理细胞后，细胞黏附率和迁移细胞数较处理前显著减少，SSeCKS在细胞内散在分布，且纤维肌动蛋白(Filament actin，F-actin)骨架结构发生重组，SSeCKS在内皮细胞增殖后期表达增加。 (2)SSeCKS的表达水平与LPS用量呈现剂量和时间依赖关系：在1、5、10和15mg／kg组SSeCKS mRNA水平的表达量皆显著高于对照组(P＜0.05)，且随LPS注射剂量增高，SSeCKS mRNA表达量亦逐渐增高；而不同时相中，LPS(5mg／kg)注射后肺组织中SSeCKS mRNA水平表达呈动态变化过程，1h开始增高，3h达到表达高峰，12h降至正常水平；SSeCKS蛋白水平表达变化与mRNA水平变化相一致。SSeCKS在肺组织中定位于肺泡间隔毛细血管EC。 (3)LPS、TNF-α、IL-1β以时间依赖的方式诱导EC中SSeCKS表达增加；经LPS、TNF-α和IL-1β刺激后，F-actin发生重构，SSeCKS向核周、细胞膜纤维状、板状伪足聚集；PKC抑制剂Calphostin C可抑制LPS、TNF-α和IL-1β对内皮细胞F-actin和SSeCKS细胞内定位改变的影响。细胞免疫荧光和Western blotting检测显示SSeCKS siRNA能够显著下调SSeCKS蛋白水平的表达(P＜0.05)，引起一系列变化：EC骨架结构发生改变，细胞内应力纤维增粗增多；LPS、TNF-α和IL-1β刺激EC引起的骨架结构改变受到抑制；LPS、TNF-α和IL-1β刺激EC后ERK磷酸化受到抑制。 【结论】 (1)SSeCKS在EC粘附、迁移过程中的表达和细胞内定位发生改变，提示了SSeCKS可能通过细胞骨架结构的改变，在EC粘附、迁移过程中发挥重要作用。SSeCKS在内皮细胞增殖后期表达增加提示SSeCKS可能参与内皮细胞周期的负性调控。 (2)内毒素以时间和剂量依赖的方式诱导肺组织SSeCKS表达上调，，提示SSeCKS作为PKC的底物，在PKC信号途径参加炎症反应中，可能具有一定的意义。 (3)LPS、TNF-α和IL-1β能诱导EC中F-actin重构及SSeCKS表达和亚定位发生改变；抑制PKC活性和封闭内源性SSeCKS表达均可阻断LPS、TNF-α和IL-1β诱导的EC骨架结构改变，并使ERK的磷酸化水平增高受抑制。这提示SSeCKS可能通过与PKC结合，参与炎症刺激EC骨架结构改变。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：南通大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2006
【分类号】：R392

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本文编号：2319954