叶酸缺乏对斑马鱼心血管系统发育影响的实验研究

发布时间：2018-12-10 16:44

【摘要】： 叶酸在生物生长和发育过程中扮演重要的角色，它参与生物体内许多重要反应和重要物质的合成。人群中叶酸缺乏会导致胎儿许多先天性异常的发生率上升，(如先天性心脏病、神经管发育异常等)。目前许多模式生物应用于叶酸缺乏导致先天性发育异常的研究，在这些模式生物中同样发现叶酸缺乏可导致心脏发育异常。但目前叶酸缺乏导致先天性发育异常的机制仍不明确。 1．叶酸缺乏斑马鱼模型的建立 本实验利用DHFR拮抗剂MTX和将DHFR基因knock-down的方法构建叶酸缺乏的两种斑马鱼模型。在我们采用化学遗传学的方法即用叶酸拮抗剂MTX构建叶酸缺乏斑马鱼模型的实验中，我们探寻了MTX影响斑马鱼心血管系统发育的特定浓度和特异性时段，并就MTX拮抗叶酸的机理进行了证实。我们还采用基因knock-down的方法，通过显微注射吗啡啉修饰的反义RNA来knock-down DHFR基因，阻断叶酸生物学活性的发挥从而构建另一类叶酸缺乏斑马鱼模型。在实验中我们通过上述两种方法构建的叶酸缺乏斑马鱼模型的心血管系统发育异常有相似性，都表现为心脏发育异常表型多样、心功能受损、心脏流出道发育异常和血管发育受到干扰。斑马鱼叶酸缺乏模型的成功建立有助于我们进行后续叶酸缺乏导致先天性发育异常机理的研究。 2．叶酸缺乏对心血管发育相关基因表达的影响 在第一部分构建的叶酸缺乏斑马鱼模型的基础上，我们在此部分实验中通过原位杂交或Q—PCR的方法检测了叶酸缺乏对心脏发育相关基因vmhc，amhc，hand2，mef2a，mef2c，bmp2b，nkx2.5，has2，以及对血管发育相关基因flk-1,ephrinB2和ephB4表达的影响。并就hand2，mef2c，bmp2b，nkx2.5和has2之间的相互作用关系进行了初步探讨，以助于了解叶酸缺乏导致此五个基因表达下调的机理。我们还初步探讨了叶酸缺乏对Hedgehog信号通路和Nodal信号通路的影响。 (1)叶酸缺乏后部分心血管发育相关基因的表达减弱 我们的实验结果表明，叶酸缺乏对心脏发育相关基因vmhc，amhc和mef2a的表达无影响，叶酸缺乏导致心脏发育相关基因hand2，mef2c，bmp2b，nkx2.5和has2的表达减弱；叶酸缺乏对血管发育相关基因ephB4的表达无明显影响，叶酸缺乏导致血管发育相关基因flk-1和ephrinB2的表达减弱。上述这些心血管发育相关基因的表达减弱可能是叶酸缺乏导致心脏发育异常的机理。 (2)hand2与mef2c、bmp2b、nkx2.5和has2相互作用的初步研究 在此部分实验中我们发现hand2、mef2c、bmp2b、has2和nkx2.5之间存在着复杂的相互作用，在斑马鱼心脏发育过程中，mef2c和bmp2b对hand2的表达有一定的调控作用，hand2可影响nkx2.5和has2的表达。叶酸缺乏可能影响了这些基因之间复杂的相互调控作用而导致心脏发育异常。 (3)在斑马鱼心脏发育过程中dhfr与hand2相互作用的研究 在本部分实验中，我们发现在斑马鱼心脏发育过程中dhfr可调控hand2的表达。dhfr knock-down后hand2的表达下调，是dhfr knock-down导致心脏发育异常的机理。hand2过表达可挽救dhfr knock-down导致的心脏发育异常表型，从而为叶酸缺乏导致心脏发育异常的基因治疗提供线索。 3．叶酸缺乏对Hedgehog和Nodal信号通路的影响 在此部分实验中，我们检测了叶酸缺乏对Hedgehog信号通路下游因子foxa2和ptc1以及对Nodal信号通路下游因子ntl和gsc表达的影响，以探寻叶酸缺乏导致心脏发育异常和右侧异位的可能机理。实验结果表明，叶酸缺乏影响了Hedgehog信号通路的功能，，但对Nodal信号通路影响不明显。叶酸缺乏导致轴中胚层发育紊乱。 4．叶酸缺乏导致斑马鱼胚胎凋亡过度 叶酸缺乏不仅只影响基因表达的水平，还可导致DNA双链断裂，造成细胞凋亡过度。在此部分实验中，我们从检测细胞凋亡水平即DNA断裂方面入手对叶酸缺乏导致心脏发育异常的机理进行初步探讨的结果表明，叶酸缺乏可以导致细胞DNA断裂增加而促使细胞凋亡的发生。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：复旦大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2007
【分类号】：R363

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本文编号：2370897