原癌基因Ret，nNOS与肠神经发育畸形HD和HAD

发布时间：2018-12-10 23:22

【摘要】： 先天性巨结肠症(Hirschprung disease,HD)于1886年由丹麦医生Harlald Hirschsprung首先描述。在先天性胃肠道畸形中HD发病率高居第二位,约占存活婴儿的1/2000—1/5000。HD在胚胎4-12周时发生,主要原因是神经节细胞不能在肠壁内聚集定位。根据其病变肠段不同,HD可分为短段型、长段型、全结肠型以及全消化道型。其主要特征是远段肠管神经节细胞减少或缺如。巨结肠同源病(Allied Hirschsprung’s disorder,HAD)的临床表现酷似HD,但其病理变化却与HD明显不同,其表现为:神经节细胞减少症(HYPG)神经节细胞不成熟症(IND)神经节细胞异位症巨大神经节细胞症。这类疾病既往常被忽视而错误地诊断为先天性巨结肠,而它的发病率可高达先天性巨结肠的20%-75%。原癌基因Ret是由Talabashi等于1985年首先在髓样甲状腺癌中发现的,是一种在DNA重组活化过程中产生的原癌基因,有80 kb,21个外显子,分为5个区。Ret原癌基因编码产物Ret蛋白(酪氨酸激酶受体)是一种超家族跨膜蛋白,在神经节细胞中有广泛表达。Ret蛋白转导信号的机制是:该受体与细胞外因子结合形成二聚体导致其构型发生变化,使得受体自身磷酸化,激活膜内区的酪氨酸激酶,同时使底物的酪氨酸磷酸化,这样信号进入到细胞内,再进一步传递给效应子(effector)、传递子(transducer)或联结子(adaptor),从而影响细胞的生理活动及生长发育。该基因发生突变会引起神经嵴细胞迁移、分化的异常从而引发疾病。神经型一氧化氮合酶(nNOS)是NO合成的限速酶,而NO是抑制性非肾上腺素能非胆碱能(NANC)神经的重要传递和调节递质,这类递质对胃肠运动产生重要的调解作用。nNOS神经元和神经纤维直接产生NO扩散到平滑肌细胞内,激活鸟嘌呤环化酶(GC),增加cGMP的浓度,降低钙离子浓度或降低肌细胞对钙离子的敏感性,引起平滑肌松弛。另外,结肠壁环肌自主收缩反应(机械慢波)部分由粘膜下起搏区引发的电生理活动控制,而粘膜下层部分由NO能神经支配。因此nNOS表达异常也会引发相应病变。本实验采用免疫组织化学方法,观察HD、HAD及正常结肠组织中Ret、nNOS的表达情况,以探讨Ret、nNOS在神经发育上的作用意义。同时进一步了解HD、HAD两者之间的联系和区别。实验以临床确诊的HD和HAD病例为模型, 26例标本均来自同济医院病理科术后病理诊断的存档蜡块。其中HD组15例,男12例,女3例;HAD组11例,男8例,女3例,年龄1个月到9岁,每例采集狭窄段,扩张段组织蜡块各1块,每蜡块作连续切片3张,片厚6um。同时取正常组(即非HD和HAD的小儿外科标本)10例作对照组,年龄3岁到8岁,取其结肠组织做石蜡切片。一抗为单克隆抗体,采用链菌素亲生物蛋白—过氧化物酶(SABC)免疫组化法,从两个方面观察二者的联系和区别。第1部分比较3组不同部位Ret阳性细胞的表达状况:免疫组化法后每组取五张切片,每张切片在20×10倍显微镜下随机取五个视野,光镜下记数,对结果进行统计;第2部分重点观察神经递质(nNOS)的表达:对3组不同的部位各取5个视野,其图像经摄像仪输入电子计算机,经HMIAS-2000高清晰度彩色医学图文分析系统细胞测量程序处理,去除背景灰度,对其棕黄色反应产物的积分光密度进行统计学分析。比较3组在nNOS表达上的差异,所得数据为临床上HD和HAD的诊断提供客观的依据。实验结果:①Ret蛋白在先天性巨结肠和巨结肠同源病的扩张段以及对照组均呈现阳性反应(P0.05);在先天性巨结肠狭窄段大多数表现为阴性反应,极少数出现阳性反应;而巨结肠同源病狭窄段可见Ret免疫反应蛋白阳性细胞,且偶见巨大的阳性细胞。先天性巨结肠狭窄段分别与巨结肠同源病狭窄段和对照组比较均有统计学意义(P0.001)。②nNOS在先天性巨结肠、巨结肠同源病的扩张段及对照组均呈现阳性反应(P0.05);在先天性巨结肠狭窄段大多数表现为阴性反应,极少数出现阳性反应;而巨结肠同源病狭窄段可见为数不多的nNOS免疫反应阳性细胞,且偶见含较多阳性细胞的巨大神经丛。先天性巨结肠狭窄段分别与巨结肠同源病狭窄段和对照组比较均有统计学意义(P0.001)。实验结果提示HD和HAD的发病可能由不同的机制引起,其证据如下:①Ret蛋白在神经嵴细胞的迁移、分化、发育上有重要作用,其表达异常可引起HD的发病;但Ret蛋白与HAD的关系不密切,而且基因学上也多次证明HAD与Ret基因的突变无关。②HD的发病和nNOS的表达减少密切相关;而HAD的发病可能与ENS发育过程中不良环境刺激引起的神经递质表达紊乱有关。
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【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2006
【分类号】：R363

【参考文献】