结核分枝杆菌Rpf样蛋白的生物学及免疫学活性研究

发布时间：2019-02-20 19:29

【摘要】： 结核病(Tuberculosis , TB)是由结核分枝杆菌( Mycobacterium tuberculosis,MTB)所致呼吸系统感染为主的慢性传染病,目前全球有1/3人口感染MTB,每年的新发病例约1 000万,每年约300万人因TB死亡。我国TB患者数量居世界第二位,据2000年全国TB流行病调查,我国现有MTB感染人数5亿,患者5 000万人,每年死于TB的人数达25.6万。卡介苗(BCG)是目前唯一的预防TB的疫苗,但其保护效果不稳定(保护率为0~80%),同时由于MTB的耐药菌株的流行与HIV的合并感染以及人口流动增加等因素,进一步加剧了MTB对人类的威胁。因此,积极研究MTB的致病及免疫机制,研制更为有效的诊断、预防和治疗MTB感染的新技术、新方法、新疫苗等具有重要意义。复活促进因子(Resuscitation promoting factor,Rpf)最早在藤黄微球菌(Micrococcus luteus)中发现,它可以促进休眠期MTB的生长。Rpf样蛋白广泛存在于革兰阳性菌中,并与革兰阳性菌生物活性相关。MTB Rpf家族有五种蛋白,分别是Rv0867c、Rv1009c、Rv1884c、Rv2389c和Rv2450c。对Rpf家族的研究发现,Rpf样蛋白不仅与细菌的增殖有关,还有可能是宿主免疫系统识别的一个靶抗原。在本研究中,我们分别在大肠埃希菌(E. coli)和母牛分枝杆菌(M. vaccae)中表达并纯化了Rv0867c、Rv1884c和Rv2389c融合蛋白,研究了这些融合蛋白刺激细菌增殖功能的作用机理和本身的免疫学特性,评价其作为快速培养检验MTB和新的TB基因工程疫苗或亚单位疫苗的候选组分的可能性。实验方法和结果: 1.MTB Rpf样蛋白的表达与纯化根据GenBank公布的MTB H37Rv株Rpf家族基因Rv1884c和Rv2389c全长cDNA序列,借助计算机软件PrimerPremier 5.0设计了含有相同酶切位点的4条引物。采用PCR方法以MTB H37Rv株的基因组DNA为模板分别扩增出相应大小的目的片段。将不同的目的基因片段分别克隆入载体pGEM-T-easy中,将其与pGEM-T-easy-Rv0867c一起进行测序,结果与GenBank报道的完全一致。将测序正确的Rv0867c克隆入表达载体pET19b,重组入E. coli DE3菌株中表达;Rv1884c和Rv2389c片段分别克隆入表达载体pPRO-EXHT-B和分枝杆菌穿梭载体pDE-22中,酶切鉴定阳性重组子,分别重组入E. coli DH5α和M. vaccae中,并通过IPTG或热诱导进行诱导表达。SDS-PAGE分析的结果表明成功地表达出了相应的5种融合蛋白:Rv0867c(E)、Rv1884c(E)、Rv1884c(M)、Rv2389c(E)和Rv2389c(M);用6×His的单克隆抗体进行Western-blot分析的结果也显示在相应条带处有特异性的阳性反应,其分子量与各自蛋白的预计大小相符或不相符。随后采用Ni2+-NTA亲和色谱柱纯化得到了5种融合蛋白,定量后保存于-20℃。 2.MTB Rpf样蛋白的生物学及免疫学活性研究 2.1 Rpf样蛋白的生物学活性研究复制结核休眠菌模型成功后,取适宜稀释度的休眠状态的MTB H37Ra株培养液分为5组,分别加入纯化的融合蛋白,37℃培养。每五天分别取少量培养液测OD600值,根据测定结果绘制不同剂量融合蛋白对于MTB生长的曲线图。确定各组蛋白的最佳浓度后,将休眠状态的MTB H37Ra株随机分为3组,分别加入最佳浓度的Rv0867c(E)与相应的兔抗Rv0867c(E)多抗血清;最佳浓度的Rv2389c(E)、Rv2389c(M)与相应的兔抗Rv2389c(E)多抗血清,37℃培养。每五天分别取少量培养液测OD600值,根据测定结果绘制MTB生长的曲线图。结果表明,Rv0867c和Rv2389c融合蛋白可以促进MTB H37Ra的快速复苏,而且在M. vaccae中表达的比E. coli表达的Rv2389c融合蛋白有着更强的复苏刺激作用;两种系统表达的Rv1884c融合蛋白对MTB的复苏均没有作用。MTB的复苏与加入的Rpf融合蛋白不呈剂量依赖性关系。制备的两种兔多抗血清在适宜的滴度可以完全抑制两种蛋白的复苏刺激作用。 2.2 Rpf样蛋白的免疫学活性研究取预先转移到硝酸纤维素膜上的5种纯化的Rpf样蛋白,采用皮下包埋的方法免疫小鼠三次,每次间隔2周。用各自的纯化蛋白作为抗原,以ELISA方法测定免疫小鼠血清中的特异性抗体滴度。结果Rv0867c免疫小鼠的抗体滴度平均为1∶1600;M. vaccae表达的Rv1884c免疫小鼠的抗体滴度平均为1∶400;E. coli DH5α表达的Rv1884c免疫小鼠的抗体滴度平均为1∶200;M. vaccae表达的Rv2389c免疫小鼠的抗体滴度平均为1∶200;E. coli DH5α表达的Rv2389c免疫小鼠的抗体滴度平均为1∶800。为了检测Rpf样蛋白免疫小鼠引起的细胞免疫应答,最后一次免疫完成两周后,分离各组免疫小鼠的脾淋巴细胞,经PPD刺激后,分别用MTT法进行淋巴细胞增殖实验以及用ELISA夹心法检测IFN-γ和IL-2。淋巴细胞增殖实验的结果表明,5种Rpf融合蛋白免疫小鼠的脾淋巴细胞增殖以Rv0867c免疫组最为显著,其刺激指数为3.57,明显高于生理盐水对照组(P0.05),但与BCG免疫组相比仍有较大差距(P0.05);其次为E. coli DH5α表达的Rv2389免疫组,为2.64,而M. vaccae表达的Rv2389c免疫组的刺激指数为2.08,两者均高于生理盐水对照组(P0.05);M. vaccae表达的和E. coli DH5α表达的Rv1884免疫组的刺激指数分别为1.14和1.39,与生理盐水阴性对照组淋巴细胞的增殖指数相当(P0.05)。两种细胞因子检测的结果表明,(1)Rv0867c融合蛋白免疫组IFN-γ水平为613.55±73.71ng/L,IL-2水平为477.62±45.92ng/L,均明显高于生理盐水对照组(P0.05),说明Rv0867c融合蛋白可诱导小鼠产生获得性免疫反应,但是作为单一抗原,其诱生的细胞因子水平与BCG相比还是有一定差距(P0.05)。(2)E. coli DH5α表达的和M. vaccae表达的Rv2389c免疫组的IFN-γ含量分别为401.01±43.46ng/L和388.58±30.92ng/L,高于生理盐水对照组(P0.05),但与Rv0867c融合蛋白免疫组IFN-γ水平相比有差距(P0.05);两个系统表达的Rv1884c免疫组的IFN-γ含量分别为133.76±22.53ng/L和149.61±20.06ng/L,均与生理盐水阴性对照相当(P0.05)。(3)E. coli DH5α表达的和M. vaccae表达的Rv2389c免疫组的IL-2含量分别为275.49±25.53ng/L和291.29±15.41ng/L,高于生理盐水对照组(P0.05),但与Rv0867c融合蛋白免疫组IL-2水平相比有差距(P0.05);两个系统表达的Rv1884c免疫组的IL-2含量分别为120.61±4.65ng/L和114.93±20.58ng/L,均与生理盐水阴性对照相当(P0.05)。无论是E. coli表达还是M. vaccae表达,Rv1884c融合蛋白均只能刺激产生少量的IFN-γ和IL-2。在免疫完成后第二周,用106CFU的MTB H37Rv株经尾静脉攻击上述各组免疫小鼠,四周后处死小鼠并计数脾脏的荷菌数。结果表明,与生理盐水对照组相比较,Rv0867c融合蛋白免疫组小鼠对毒株攻击后在脾脏中的增殖有显著抵抗作用,但仍不如BCG免疫组提供的保护作用有效;E. coli DH5α表达的和M. vaccae表达的Rv2389c融合蛋白免疫可以提供微弱的保护作用;而E. coli DH5α表达的和M. vaccae表达的Rv1884c融合蛋白免疫没有保护作用。结论:MTB的Rpf样蛋白Rv0867c和Rv2389c蛋白具有促进休眠的MTB复苏的作用,同时Rv0867c蛋白免疫动物后还可诱导产生特异性的细胞免疫应答和保护性反应。因而它们有可能用做临床标本分离培养过程中的添加剂;同时它们也有可能作为新的TB基因工程疫苗或亚单位疫苗的候选组分,值得进一步深入研究。
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【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2007
【分类号】：R378;R392

【参考文献】