兔抗人凝血因子ⅩⅢ A亚单位多克隆抗体的制备、鉴定及应用研究

发布时间：2019-02-24 12:30

【摘要】： 目的： 用免疫动物方法制备FXⅢA亚单位多克隆抗体，并对其进行鉴定，检测其特异性及活性，并将多克隆抗体应用于FXⅢ缺乏的检测和FXⅢ抗原表位分析，为进一步研究FXⅢ抑制物作用机制奠定基础。 方法： 1．免疫动物法制备多克隆抗体 2．Dot blot鉴定抗体，抗体中和／尿素溶解实验检测多克隆抗体活性 3．Western blot检测FXⅢ缺乏及dot blot分析抗原表位 结果： 1．(1)以兔抗人FXⅢ抗血清孵育过夜的PVDF膜在纯化的人FXⅢ、含转氨酶活性位点多肽Ⅱ点样处均出现阳性信号，，而在含钙离子结合位点多肽Ⅰ点样处无阳性信号。 (2)正常血浆与兔血清(0ul，10ul，40ul，80ul)混合孵育，加入CaCl_2溶液后，4管均有血浆纤维蛋白凝块形成，大小基本相同，再加入5M尿素溶液1h后，第1管纤维蛋白凝块基本无变化，而第2，3，4管均有不同程度的缩小，且缩小的程度依抗血清量的增加依次递增。 2．(1)用纯化的人FXⅢ蛋白、正常血浆电泳转膜后的PVDF膜上，当用制备的抗血清作一抗、用辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG作二抗，在82.5KD的位置均有阳性信号，而FXⅢ缺乏病例1血浆在82.5KD的位置处有较弱的阳性信号，FXⅢ缺乏病例2血浆在82.5KD的位置处没有阳性信号。 (2)以FXⅢ缺乏病例1血清孵育后，再加兔血清孵育过夜的PVDF膜在含转氨酶活性位点多肽Ⅱ点样处出现阳性信号；纯化的人FXⅢ和含钙离子结合位点多肽Ⅰ点样处均无阳性信号。而以FXⅢ缺乏病例2血清孵育后，再加兔血清孵育过夜的PVDF膜在纯化的FXⅢ、含钙离子结合位点多肽Ⅰ、含转氨酶活性位点多肽Ⅱ点样处均未见阳性信号。 结论： 1．用免疫动物法成功制备了针对FXⅢA亚单位转氨酶活性位点的兔抗人多克隆抗体，此抗体不仅可特异性与纯化的人FXⅢ及含转氨酶活性位点多肽结合，而且在体外可以抑制人FXⅢ活性。 2．应用此抗体可检测FXⅢ缺乏，且分析出FXⅢ缺乏病例2的血浆中FXⅢ抑制物作用位点为转氨酶活性位点，而FXⅢ缺乏病例1的血浆中FXⅢ抑制物作用位点不是转氨酶活性位点。
[Abstract]:Objective: to prepare and identify the polyclonal antibody of FX 鈪

本文编号：2429553