小鼠骨髓间质干细胞的分离及其诱导定向脂肪细胞分化

发布时间：2019-03-12 15:19

【摘要】： 骨髓间充质干细胞(MSCs)是一种具有高度增殖和分化潜能的干细胞，也是较原始的细胞，常维持在低分化状态。它的多向分化潜能在神经、血液、心肌梗死和肿瘤的治疗多方面取得成效，广泛应用于自体和异体移植。并且易于转导而成为基因治疗的靶向物，从分子水平成为很多疑难杂症的治疗新途径。就整形烧伤及组织工程学方面，定向分化为脂肪细胞有其重要作用。国内外已经用人，兔，猪，鼠，狒狒等物种提取MSCS来分化为脂肪细胞。控制成脂细胞基因包括AP_2，PPAR_2，CEBP_(12)，CEBP／β等转录因子。其中BMS既支持脂肪前体的形成，也支持成熟脂肪细胞的形成。而BMP虽然也是调控因子，但在不同的情况下起促进还是抑制作用有一定争议，BMP-2在成脂分化中是起促进作用，而在原代MSC培养中又起抑制作用。而近几年来也有新的发现，降血糖药例如罗格列酮或者是低氧环境有极大的促进成脂作用。在较早的报道中，，地塞米松(DXM)是最主要的诱导剂，它可以促进成脂及成软骨上调基因的表达，但单用生成比例较低。之后Janderova通过对比筛选法建立MSCs向脂肪细胞分化的较佳方案，合用199培养基，胰岛素，3-异丁基-1-甲基黄嘌呤，消炎痛，地塞米松及5％的胎牛血清。而Scavo等指出若加入极微小浓度(纳摩尔)的胰岛素样生长因子IGFI即可刺激并且促进生长。以上的研究虽然列出主要诱导剂，但在促进成脂肪细胞的生成百分比不一。另外，MSCs在分化的过程中相似的诱导剂在不同的剂量或处理条件下会使之向骨及软骨组织和脂肪组织几个方向分化，只是所占比例不同，脂肪比例少时只有6％-10％，生成成熟脂肪细胞的条件不稳定。那么本文旨在研究最适宜的诱导方案，优化诱导条件，通过免疫组化的方法加以鉴定，最大程度的定向成脂。我们观察到传代后纯化的MSCS成脂后油红染色呈桔红色，胞内充满脂肪滴，倒置显微镜下目测十个非重叠视野统计后成熟脂肪细胞比例达90％以上。检测碱性磷酸酶染色阳性，MAC-1和Ⅷ因子染色阴性，排除巨噬细胞，中性粒细胞和造血细胞的可能。本实验为组织工程和进一步研究在生理病理状态下MSCS成脂过程奠定基础。目的建立小鼠骨髓间质干细胞(MSCs)的分离和鉴定方法；稳定和优化骨髓间充质干细胞在体外定向向脂肪细胞分化的适宜诱导条件；初步探索其向脂肪细胞组织工程的可行性，为解决临床软组织缺损的损伤修复和整形难题提供理论和实践基础。方法采取贴壁细胞分离法，分离和纯化小鼠骨髓MSCs；选用第5代小鼠骨髓MSCs，分别采用CFU-f培养法和CFU-f集落再克隆生成CFU-f集落法鉴定骨髓MSCs的增殖和自我更新能力；利用不同组合的成脂培养基定向诱导骨髓MSCs分化为脂肪细胞；利用油红0免疫组化染色鉴定分化后的细胞。结果分离和纯化的小鼠骨髓MSCs呈均匀有序的成纤维母细胞样形态；植入2000个～100000个细胞／皿时，可生成不同比例的纯的CFU-f集落，所生成纯的CFU-f集落数与种入的细胞数呈良好的线性关系；小型CFU-f集落再克隆生成CFU-f集落的能力较弱；而大型CFU-f集落具有较高的再克隆生成CFU-f集落的能力，再克隆生成CFU-f集落率高达90％，而且往往一个目的集落可再克隆生成多个CFU-f集落；不同诱导方案均可诱导MSC生成脂肪细胞，而合用地塞米松、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、胰岛素和消炎痛时效果最佳，诱导MSC生成脂肪细胞的效率可高达96％以上。绝大多数为油红0染色阳性的成熟脂肪细胞。结论实验结果表明我们采取贴壁细胞分离法，经过长期传代可得到纯化的小鼠骨髓MSCs；这种小鼠骨髓MSCs具有高度的增殖能力、自我更新能力和定向分化为脂肪细胞的能力。1-甲基-3-异丁基黄嘌呤、地塞米松、胰岛素、消炎痛四种诱导剂合用可导致96％以上的小鼠骨髓MSCs定向分化为成熟脂肪细胞。
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【学位授予单位】：中南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2007
【分类号】：R329

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