幽门螺杆菌CagA真核绿色荧光蛋白表达载体的构建

发布时间：2019-03-24 15:00

【摘要】： 背景与目的：目前已经确认幽门螺杆菌(Helicobacter pylori，H．pylori)与上消化道疾病中的4中疾病密切相关：①慢性胃炎；②消化性溃疡；③胃癌；④胃黏膜相关淋巴组织淋巴瘤(MALT)。根据H．pylori是否含有细胞毒素相关基因A(cytotoxin-associated gene A，CagA)和空泡毒素基因(vacuolating cytotoxin gene A，VacA)将H．pylori分为Ⅰ型菌株(CagA~+、VacA~+)和Ⅱ型菌株(CagA~-、VacA~-)。Ⅰ型菌株含有一个约40kb的特殊基因片段，因其编码CagA等毒力因子而被称为CagA毒力岛。1997年到1998年，2个H．pyloriⅠ型菌株26695菌株和J99菌株的基因组被完全测序，并比较两种菌株，使人们能全面了解HpⅠ型菌株的基因组结构和主要特征。鉴于Ⅰ型菌株现被认为是消化性溃疡和胃肿瘤的重要原因，因此CagA基因的研究成为H．pylori研究中的热点。目前，治疗H．pylori感染主要应用抗生素和质子泵抑制剂，但抗生素的广泛应用会导致Hp耐药性的不断增加，复发率高。因此，防治H．pylori感染非常必要。但目前尚未研制出有效的实用的HpⅠ型菌株疫苗。为此，本研究拟用分子生物学技术，并构建含CagA的绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-C3-CagA，并在真核细胞中表达，为H．pylori重组疫苗的研制提供备选抗原，也为H．pyloriⅠ型菌株的鉴定试剂盒提供抗原参考。 方法：根据GenBank收录的Hp CagA序列，设计PCR引物，并在每条引物前分别添加内切酶位点。通过PCR扩增出幽门螺杆菌细胞株中CagA基因片段，运用分子克隆的经典方法，用pGEM-T easy质粒载体携带该基因转化工程菌JM109，继而通过蓝白筛选出阳性菌落并对该基因测序，将其结果与已公布的CagA基因序列比对。测序结果正确后再将CagA基因从pGEM-T-CagA重组体中提取，用质粒pEGFP-C3携带该基因转化宿主菌JM109，通过卡那霉素抗性筛选出阳性克隆pEGFP-C3-CagA。而后用脂质体法将pEGFP-C3-CagA转染入胃癌细胞株BGC823中，用荧光显微镜观察其在真核细胞中的表达。 结果： 1．目的基因扩增：从H．pylori菌株中，利用PCR扩增得到CagA目的基因(507bp)，，加上两端内切酶位点共523bp。 2．正确构建pGEM-T-CagA原核重组质粒，目的基因的测序结果与GenBank公布的同源性达100％。 3．成功构建出绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-C3-CagA，转染后在真核细胞中广泛表达。 结论： 1．成功获得幽门螺杆菌菌株CagA保守区基因序列。 2．正确构建绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-C3-CagA，并在胃癌细胞株BGC823中获得了表达。 3．建立了CagA的真核表达系统，为H．pylori重组疫苗的研制提供了备选抗原，同时也为H．pyloriⅠ型菌株的鉴定试剂盒提供抗原参考。
[Abstract]:Background & objective: Helicobacter pylori (Helicobacter pylori,H.pylori) has been confirmed to be closely associated with 4 intermediate diseases in upper gastrointestinal diseases: (1) chronic gastritis; (2) peptic ulcer; (3) gastric cancer; (4) gastric mucosal associated lymphoid tissue lymphoma (MALT).) According to whether H.pylori contains cytotoxin associated gene A (cytotoxin-associated gene A) and vacuolating toxin gene (vacuolating cytotoxin gene A (Vaca), H.pylori is divided into CagA~ (VacA~) and type 鈪

本文编号：2446426