肾上腺髓质素对LPS抑制人脐静脉内皮细胞TFPI基因表达的影响及其分子机制

发布时间：2019-03-25 18:55

【摘要】： 【研究背景】肾上腺髓质素(Adrenomedullin，ADM)最初是从人嗜铬细胞瘤中分离出来的一种血管舒张肽，它具有包括舒张血管、利尿、抑制醛固酮分泌等在内的多种生物学效应。近年来的研究还发现，它具有抗凝活性，对脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)诱导的感染性休克具有抵抗作用，然而，目前关于ADM抵抗感染性休克的机制尚未完全明确。感染性休克最常见的并发症是弥散性血管内凝血(Disseminatedintravascular coagulation，DIC)。LPS可以通过组织因子(Tissue factor，TF)／因子Ⅶa(FⅦa)依赖的凝血途径诱发DIC，，是感染性休克发生DIC的主要激活物。而ADM的抗凝活性是否有助于其对感染性休克的抵抗作用并不清楚，本研究旨在观察ADM对LPS抑制的人脐静脉内皮细胞(Human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)组织因子途径抑制物(Tissue factor pathway inhibitor，TFPI)(机体内的主要抗凝因子)表达的作用，并进一步阐明这种效应的分子机制。【研究内容与方法】本研究以体外原代培养的人脐静脉内皮细胞(Human umbilical vein endothelialcells，HUVECs)作为靶细胞，主要采用下述实验方法进行了4个方面的研究：一．ADM和／或LPS对HUVECs TFPI基因表达的影响 1．HUVECs分离、培养及鉴定； 2．采用发色底物法检测HUVECs培养液中TFPI的蛋白活性，选择ADM、LPS的最佳作用时间和浓度，观察ADM在LPS存在条件下对HUVECs TFPI表达活性的影响； 3．应用RT-PCR技术分析ADM在LPS存在条件下对HUVECs TFPI mRNA表达水平的影响。二．ADM拮抗LPS抑制HUVECs TFPI基因表达的信号转导途径 1．采用促分裂原活化蛋白激酶激酶MAPKK (Mitogen-activated protein kinasekinase)特异性抑制剂PD98059观察MAPK途径在ADM拮抗LPS抑制的HUVECs TFPI表达中的信号转导作用； 2．采用蛋白激酶C (Protein kinase C，PKC)抑制剂H7和Staurosporine观察PKC途径在ADM拮抗LPS抑制的HUVECs TFPI表达中的信号转导作用； 3．采用cAMP抑制剂Rp-isomer-8-bromo-cAMP(简称Rp-cAMP)及其类似物8-bromo-cAMP观察cAMP途径在ADM拮抗LPS抑制的HUVECs TFPI表达中的信号转导作用； 4．采用激光共聚焦显微镜技术(Laser-scanning confocal microscope)，观察在ADM、LPS作用下单个HUVEC胞内钙离子水平的变化，并辅以钙离子拮抗剂Amlodipine，探讨钙离子信号途径在ADM拮抗LPS抑制的HUVECs TFPI表达中的作用。三．核转录因子GATA-2、SP1和c-Myc在HUVECs TFPI基因转录调控中的作用 1．应用EMSA和超迁移(Super Shift)实验，观察ADM和／或LPS对TFPI基因表达相关核转录因子GATA-2、SP1和c-Myc与其相应的顺式作用元件结合活性的影响； 2．采用Western Blot杂交技术，观察ADM和／或LPS对TFPI基因表达相关的核转录因子GATA-2、SP1和c-Myc水平的影响。四．TFPI基因5’上游不同长度启动子区中GATA-2、SP1和c-Myc调节元件在HUVECs TFPI基因转录调控中的作用 1．采用PCR和基因重组技术，构建含人TFPI基因5’上游不同长度调控序列的荧光素酶报告基因质粒； 2．应用真核基因转染技术，分析TFPI基因5’上游不同长度调控序列在ADM拮抗LPS抑制的HUVECs TFPI基因转录中的调控作用； 3．采用重叠延伸特异位点诱变法，构建含人TFPI基因5’上游-1247bp至-381bp序列之间GATA-2和SP1顺式作用元件定点突变序列的荧光素酶报告基因质粒； 4．应用真核基因转染技术，分析TFPI基因5’上游GATA-2和SP1顺式作用元件在ADM拮抗LPS抑制的HUVECs TFPI基因转录中的作用。【研究结果】 1．本研究中，ADM呈浓度和时间依赖性地诱导HUVECs中TFPI的蛋白活性和mRNA的表达，LPS的作用则相反，呈剂量依赖性地抑制HUVECs TFPI的蛋白表达，ADM可以拮抗LPS所致TFPI表达的降低。 2．MAPKK抑制剂PD98059以及cAMP抑制剂Rp-cAMP均显著抑制ADM对LPS影响TFPI表达的拮抗作用；cAMP类似物8-bromo-cAMP可直接上调LPS抑制的TFPI的表达。 3．PKC抑制剂H7和Staurosporine对ADM拮抗LPS抑制TFPI表达的作用无显著影响。 4．激光扫描共聚焦显微镜观察显示，ADM使单个HUVEC胞内游离钙离子浓度([Ca~(2+)]i)缓慢平稳地下降，而LPS可使胞内游离钙离子浓度([Ca~(2+)]i)迅速短暂地增加，预先给与HUVEC ADM后，LPS所致钙离子浓度([Ca~(2+)]i)的增加程度和速度显著下降；钙离子抑制剂Amlodipine可上调LPS所致TFPI表达的下降。 5．EMSA和Super Shift实验证实，TFPI表达相关的核转录因子GATA-2、SP1和c-Myc可以与其相应的GATA-2、SP1和c-Myc调节元件发生特异性结合；在ADM作用下，核转录因子GATA-2和SP1与其相应调节元件的结合活性增加，LPS则使其结合活性下降，ADM对LPS所致结合活性的下降具有拮抗作用。核转录因子c-Myc与其调节元件的结合活性则无显著变化。 6．Western Blot杂交结果显示，ADM可显著增加HUVECs胞内核转录因子GATA-2、SP1的蛋白含量，相反，LPS则降低GATA-2和SP1的蛋白含量，ADM可拮抗LPS的作用；核转录因子c-Myc的蛋白含量则无显著变化。 7．瞬时转染分析实验结果显示，TFPI基因5’上游启动子区-1247bp和-381bp之间的序列在ADM和／或LPS调节荧光素酶的表达中具有重要作用，此间序列内含有3个GATA-2和1个SP1调节元件。 8．定点突变实验结果显示，上述3个GATA-2和1个SP1调节元件的突变均使LPS抑制的荧光素酶表达活性增加，ADM对LPS的拮抗作用也下降；此外，GATA-2调控序列的突变可使HUVECs基础荧光素酶表达活性下降，而SP1的突变则对荧光素酶的基础表达活性无明显影响。【研究结论】本研究结果表明，ADM可以通过cAMP、MAPK和钙离子信号途径拮抗LPS对HUVECs TFPI表达的下调。核转录因子GATA-2和SP1以及TFPI基因5’上游启动子区-1247bp至-381bp之间相应的GATA-2和SP1调节元件在TFPI的调节性表达中起着重要作用。本研究对ADM拮抗LPS抑制HUVECs TFPI表达效应，以及TFPI表达调控机制的阐明有助于通过应用ADM或干涉TFPI的基因表达途径改善脓毒血症、感染性休克等严重炎症性疾病的凝血状态。
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【学位授予单位】：中国协和医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2007
【分类号】：R363

【参考文献】