有机溶剂中毒性神经病细胞骨架的损伤及其损伤机制

发布时间：2019-05-05 14:24

【摘要】： 研究目的正己烷(n-hexane)和二硫化碳(carbon disulfide，CS_2)是常用的工业溶剂。正已烷主要应用于粘胶配制、除污、干洗、植物油提取、制鞋、印刷、油漆、制药、家具制造及电子元件制造等行业，而CS_2则广泛应用于粘胶纤维、玻璃纸、四氯化碳和杀虫剂等生产过程。长期职业接触正己烷、CS_2可引起以感觉运动型周围神经病为主要临床特征的慢性中毒。早期表现为手足部感觉异常，痛觉、触觉减退呈手套、袜套样分布，进一步发展可表现为四肢无力、行走困难以至瘫痪。主要的病理改变发生在肢体远端最长、最粗的感觉和运动神经轴索，并在郎飞氏节附近形成巨大的充满神经丝(neurofilament，NF)的肿胀，郎飞氏节解剖结构扭曲且髓鞘从肿胀处回缩，有时伴有节段性脱髓鞘，最后轴索发生变性。正己烷、CS_2中毒周围神经病的发生机制尚不清楚，但由于二者在神经行为学改变和病理改变上都非常相似，提示它们可能分享相同或相似的分子机制。同时，病理形态学研究提示NF、微管(microtubule，MT)等骨架蛋白可能参与了中毒性轴索病变的发生。国内外的研究已经报道，2，5-己二酮(2，5-hexanedione，HD)、CS_2亚慢性染毒可引起大鼠神经组织中NF含量的减少，但对这种变化发生的原因以及在它们在中毒性神经病中的作用没有进行深入探讨。因此，细胞骨架在中毒性周围神经病中的作用并没有真正阐明。本文通过建立亚慢性中毒动物模型，观察正己烷、CS_2中毒性神经病发生过程中NF-H、NF-M、NF-L、α-tubulin、β-tubulin和β-actin等细胞骨架蛋白相对含量的变化，在此基础上进一步研究毒物对细胞骨架蛋白的基因转录、蛋白降解的影响，以探讨有机溶剂中毒性周围神经病的发病机制。研究方法 1雄性Wistar大鼠用400mg／kg．bw的HD腹腔注射染毒，染毒时间分别为2、4和8周，建立正己烷中毒性周围神经病模型，并取一半8周染毒动物继续观察至24周。雄性Wistar大鼠分别用300、500mg／kg．bw的CS_2灌胃染毒，连续12周，建立CS_2中毒性周围神经病模型。 2取大鼠大脑、脊髓和坐骨神经组织制备匀浆，100，000×g、4℃离心60min。利用Western-Blotting技术研究大鼠大脑、脊髓、坐骨神经上清和沉淀中NF-H、NF-M、NF-L、α-tubulin、β-tubulin和β-actin等骨架蛋白以及钙激活的中性蛋白酶m-calpain和μ-calpain含量的变化。 3取大鼠大脑和脊髓组织，提取总RNA，利用RT-PCR技术研究HD和CS_2染毒对大鼠中枢神经组织中NF-H、NF-M、NF-L、α-tubulin、β-tubulin和β-actin mRNA表达水平的影响。 4取大鼠大脑、脊髓和坐骨神经组织制备匀浆，8，000×g，4℃离心30min。利用Calbiochem(?) InnoZymeTM Calpain 12 Activity Kit检测大鼠大脑、脊髓、坐骨神经组织中calpains总活性的变化。研究结果 1动物模型的建立以及神经行为学指标的变化给予HD、CS_2染毒后，动物逐渐出现肌肉松弛、肌张力降低、步态异常以至瘫痪等症状，神经行为学测试表明染毒大鼠呈现典型的中毒性周围神经病特征，这提示正己烷、CS_2中毒性周围神经病模型建立成功。同时HD染毒停止后，染毒大鼠的感觉运动指标能够逐渐改善。 2 HD、CS_2染毒大鼠神经组织中细胞骨架蛋白含量的变化 2．1 HD染毒大鼠神经组织中细胞骨架蛋白含量的时间变化趋势 2．1．1大脑 NF-H：与对照相比，大脑上清中NF-H的含量在HD染毒第2、4和8周时分别下降31.6％、40.3％和42％(P＜0.01)，大脑沉淀中NF-H的含量分别下降11.1％(P＜0.05)、51.8％和53.2％(P＜0.01)。 NF-M：与对照相比，大脑上清中NF-M的含量在HD染毒第2、4和8周时分别下降34.7％、58.2％和77.2％(P＜0.01)，大脑沉淀中NF-M的含量分别下降29.4％、50.6％和72.5％(P＜0.01)。 NF-L：与对照相比，大脑上清中NF-L的含量在HD染毒第2、4和8周时分别下降28％、35.4％和46.3％(P＜0.01)，大脑沉淀中NF-L的含量分别下降18％、34.7％和34.7％(P＜0.01)。 β-tubulin：与对照相比，大脑上清中β-tubulin的含量在HD染毒4周和8周时分别升高29％和33％(P＜0.01)，大脑沉淀中β-tubulin的含量在HD染毒8周时也升高16.3％(P＜0.05)。 α-tubulin和β-actin：与对照相比，大脑上清和沉淀中α-tubulin和β-actin的含量在HD染毒后未发生明显变化。 2．1．2脊髓 NF-H：与对照相比，脊髓上清中NF-H的含量在HD染毒第2、4和8周时分别下降16％、57％和58％(P＜0.01)，脊髓沉淀中NF-H的含量在HD染毒第4和8周时分别下降33％和43％(P＜0.01)。停药16周后，NF-H的含量恢复正常。 NF-M：与对照相比，脊髓上清中NF-M的含量在HD染毒第2、4和8周时分别下降36％、61％和65％(P＜0.01)，脊髓沉淀中NF-M的含量分别下降23％、34％和64％(P＜0.01)。停药16周后，NF-M含量又恢复正常。 NF-L：与对照相比，脊髓上清中NF-L的含量在HD染毒第2、4和8周时分别下降21％、44％和45％(P＜0.01)，脊髓沉淀中NF-L含量在第4和8周时分别下降26％和42％(P＜0.01)。停药16周后，NF-L含量又恢复正常。 α-tubulin、β-tubulin和β-actin：除HD染毒第8周时脊髓上清中β-tubulin的含量升高34.8％(P＜0.01)外，其余均未发生明显变化。 2．1．3坐骨神经 NF-H：与对照相比，坐骨神经上清中NF-H的含量在HD染毒第2、4和8周时分别下降19％、22％和43％(P＜0.01)，坐骨神经沉淀中NF-H含量在HD染毒第4和8周时分别下降12％和51％(P＜0.01)。停药16周后，NF-H含量又恢复正常。 NF-M：与年龄匹配的对照相比，坐骨神经上清中NF-M的含量在HD染毒第2、4、8周以及停止染毒16周时分别下降15％、24％、88％和83％(P＜0.01)，坐骨神经沉淀中NF-M的含量分别下降12％、19％、54％和41％(P＜0.01)。 NF-L：与年龄匹配的对照相比，坐骨神经上清中NF-L的含量在HD染毒第2、4、8周以及停止染毒16周时分别下降15％、40％、58％和34％(P＜0.01)；坐骨神经沉淀中NF-L的含量在HD染毒第4和8周时分别下降27％和53％(P＜0.01)，停药16周后恢复至正常水平。 a-tubulin：与对照相比，坐骨神经上清中a-tubulin的含量在HD染毒2、4、8周以及停药16周时均无显著性差异(P＞0.05)，坐骨神经沉淀中a-tubulin的含量在HD染毒2、4、8周以及停药16周后分别下降40.6％，41.2％、34.5％和14.2％(P＜0.01)。 β-tubulin：与对照相比，坐骨神经上清中β-tubulin的含量在HD染毒2、4、8周以及停药16周后β-tubulin的含量分别升高16％、44％、88.9％和86.1％(P＜0.01)，坐骨神经沉淀中β-tubulin的含量在HD染毒8周及停药16周后分别升高102.1％和99.2％(P＜0.01)。 β-actin：与对照相比，坐骨神经上清中β-actin的含量在染毒8周以及停药16周后分别下降27.1％和24.2％(P＜0.01)；坐骨神经沉淀中β-actin的含量在HD染毒2、4、8周时β-actin的含量分别升高24.8％、66.6％和103.1％(P＜0.01)，停药16周后恢复正常。 2．2 HD染毒大鼠神经组织中NFs含量变化与神经行为学改变的相关性分析 HD染毒诱导的大鼠神经组织NFs含量变化与其神经行为学改变之间存在明显的相关性。大脑中NF-H、NF-M和NF-L的含量与步态改变之间的复相关系数分别为0.8651(P＜0.0001)、0.9644(P＜0.0001)和0.8872(P＜0.0001)，脊髓中NF-H、NF-M和NF-L的含量与步态改变之间的复相关系数分别为0.8912(P＜0.0001)、0.9282(P＜0.0001)和0.8981(P＜0.0001)，坐骨神经中NF-H、NF-M和NF-L的含量与步态改变的复相关系数分别为0.9133(P＜0.0001)、0.9156(P＜0.0001)和0.9446(P＜0.0001)。 2．3 CS_2染毒大鼠神经组织中细胞骨架蛋白含量的变化 2．3．1大脑与对照相比，300、500mg／kg CS_2染毒组大脑上清中NF-H含量分别下降31％和33％(P＜0.01)，大脑沉淀中分别下降37％和45％(P＜0.01)；300、500mg／kgCS_2组大脑上清中NF-M含量分别下降52％和58％(P＜0.01)，大脑沉淀中分别下降37％和75％(P＜0.01)；300、500mg／kg CS_2组大脑上清中NF-L的含量分别下降60％和83％(P＜0.01)，大脑沉淀中分别下降57％和60％(P＜0.01)。与对照相比，α-tubulin的含量在300、500mg／kgCS_2染毒组大脑上清中分别升高20％和27％(P＜0.01)，大脑沉淀中无显著性变化；β-tubulin的含量在300、500mg／kgCS_2染毒组大脑上清中分别升高63％和71％(P＜0.01)，大脑沉淀中分别下降20％、26％(P＜0.01)；此外，β-actin的含量在500mg／kgCS_2染毒组大脑上清中升高31％(P＜0.01)。 2．3．2脊髓与对照相比，NF-H含量在500 mg／kg CS_2染毒组脊髓上清中下降37％(P＜0.01)，而在300、500mg／kg CS_2染毒组脊髓沉淀中分别下降20％、24％(P＜0.01)；NF-M含量在500mg／kg CS_2染毒组脊髓上清中下降33％(P＜0.01)，而在300、500mg／kgCS_2染毒组脊髓沉淀中分别下降16％、65％(P＜0.01)；NF-L含量在500mg／kgCS_2染毒组脊髓上清中下降68％(P＜0.01)，脊髓沉淀中下降40％(P＜0.01)。与对照相比，β-tubulin的含量在300、500mg／kgCS_2组脊髓上清中分别升高141％、158％(P＜0.01)，脊髓沉淀中分别升高107％、118％(P＜0.01)；β-actin的含量在300、500mg／kgCS_2组脊髓上清中分别升高19％、31％(p＜0.01)，脊髓沉淀中无显著性变化；此外，α-tubulin的含量均无显著性变化。 2．3．3坐骨神经与对照相比，300、500mg／kgCS_2染毒组坐骨神经上清中NF-H的含量分别下降21.3％和30.9％(P＜0.01)，沉淀中分别下降12.6％(P＞0.05)、21.4％(P＜0.01)；300、500 mg／kgCS_2染毒组坐骨神经上清中NF-M的含量分别升高21.8％、42.5％(P＜0.01)，沉淀中分别升高41％、43.4％(P＜0.01)；300、500mg／kgCS_2染毒组坐骨神经上清中NF-L的含量分别下降24.4％、26.8％(P＜0.01)，沉淀中分别下降4.6％(P＞0.05)、45.4％(P＜0.01)。与对照相比，300、500 mg／kgCS_2组坐骨神经上清中β-tubulin含量分别升高18.3％、40.4％(P＜0.01)，沉淀中分别下降18.4％和26.8％(P＜0.01)；此外，500 mg／kg CS_2组坐骨神经上清中α-tubulin、β-actin含量分别升高74％和17.3％(P＜0.01)，坐骨神经沉淀中分别下降19.7％和30.5％(P＜0.01)。 3 HD和CS_2染毒大鼠神经组织中细胞骨架mRNA表达的变化 3．1 HD染毒大鼠神经组织中细胞骨架mRNA表达的时间变化趋势 3．1．1大脑与对照相比，大脑组织中NF-L、NF-H、α-tubulin、β-tubulin、β-actin的mRNA水平在HD染毒2、4和8周时均无显著性改变，但NF-M的mRNA水平在HD染毒2、4周时分别下降13.5％和24.8％(P＜0.01)， 3．1．2脊髓与对照相比，脊髓组织中NF-L、NF-M、NF-H、β-actin、α-tubulin、β-tubulin的mRNA水平在HD染毒2、4和8周时均无显著性变化。 3．2 CS_2染毒大鼠神经组织中细胞骨架mRNA表达的变化 3．2．1大脑与对照相比，NF-M的mRNA水平在300、500 mg／kg染毒组中分别下降了21.6％和21.8％(p＜0.01)，NF-L的mRNA水平仅在500mg／kg染毒组中下降18.1％(p＜0.01)。然而，NF-H的mRNA表达未发生显著性变化。与对照相比，α-tubulin和β-actin的mRNA水平无显著性变化，而β-tubulin的mRNA水平在500 mg／kg染毒组下降13.5％(p＜0.01)。 3．2．2脊髓与对照相比，300、500 mg／kg CS_2染毒组NF-H的mRNA水平分别升高33.3％和46.2％(P＜0.01)，，NF-M的mRNA水平分别升高119.8％和181.1％(P＜0.01)，NF-L的mRNA水平分别升高101.7％和130.3％(P＜0.01)。与对照相比，300、500 mg／kg CS_2染毒组β-tubulin的mRNA水平分别升高207％和212％(P＜0.01)，β-actin的mRNA水平分别升高94％和91％(P＜0.01)，而α-tubulin的mRNA水平无显著性变化。 4．HD和CS_2染毒大鼠神经组织中calpains表达的变化 4．1 HD染毒大鼠神经组织中calpains表达的时间变化趋势 4．1．1大脑 m-calpain：与对照相比，大脑上清中m-calpain的含量在HD染毒第4、8周时分别下降15.3％和21.8％(P＜0.01)，大脑沉淀中m-calpain的含量仅在HD染毒第8周时下降17.4％(P＜0.01)。 μ-calpain：与对照相比，大脑上清中μ-calpain的含量在HD染毒第4、8周时分别升高24.6％和64.4％(P＜0.01)，大脑沉淀中μ-calpain的含量仅在HD染毒第8周时升高72.7％(P＜0.01)。 4．1．2脊髓 m-calpain：与对照相比，HD染毒第2、4和8周时脊髓上清中m-calpain含量分别下降11.6％(P＞0.05)、19.9％(P＜0.05)和20.4％(P＜0.05)，脊髓沉淀中分别下降15.8％、35.9％和54.6％(P＜0.01)。停止染毒16周后，脊髓中m-calpain的含量又恢复正常。 μ-calpain：与对照相比，脊髓上清中μ-calpain含量在HD染毒第2、4周时分别下降12.9％和24.3％(P＜0.01)，而染毒第8周时却升高62.3％(P＜0.01)，停止染毒16周后仍然升高33.6％(P＜0.01)；脊髓沉淀中μ-calpain含量在HD染毒第2、4时分别下降15.4％(P＞0.05)和23％(P＜0.01)，而染毒第8周时却升高25.2％(P＜0.01)，停止染毒16周后恢复正常。 4．1．3坐骨神经 m-calpain：与对照相比，坐骨神经上清中m-calpain的含量在HD染毒第8周以及停药16周时分别升高46％和44％(P＜0.01)；坐骨神经沉淀中m-calpain的含量在HD染毒第8周时升高61％(P＜0.01)，停药16周后恢复正常。 μ-calpain：与对照相比，坐骨神经上清中μ-calpain的含量在HD染毒第4、8周以及停止染毒16周时分别升高30％、63％和54％(P＜0.01)，而坐骨神经沉淀中分别升高31％、59％和34％(P＜0.01)。 4．2 CS_2染毒大鼠神经组织中calpains表达的变化 4．2．1大脑组织 m-calpain：与对照相比，300、500 mg／kg CS_2染毒组大脑组织中m-calpain的含量均无显著变化。 μ-calpain：与对照相比，300、500 mg／kg CS_2染毒组大脑上清中μ-calpain的含量分别升高34％、53％(P＜0.01)，大脑沉淀中分别升高74％、49％(P＜0.01)。 4．2．2脊髓组织 m-calpain：与对照相比，300、500 mg／kgCS_2染毒组脊髓上清中m-calpain的含量分别下降46％和47.8％(P＜0.01)，脊髓沉淀中无显著变化。 μ-calpain：与对照相比，300、500 mg／kg CS_2染毒组脊髓上清中μ-calpain含量分别升高39.3％和47.2％(P＜0.01)，脊髓沉淀中分别升高37.5％和36.2％(P＜0.01)。 4．2．3坐骨神经 m-calpain：与对照相比，300、500 mg／kg CS_2染毒组坐骨神经上清中m-calpain的含量分别升高18.3％和42.7％(P＜0.01)，500 mg／kg CS_2染毒组坐骨神经沉淀中m-calpain的含量升高19.3％(P＜0.05)。 μ-calpain：与对照相比，300 mg／kg CS_2染毒组坐骨神经上清中μ-calpain的含量下降19.2％(P＜0.01)，500 mg／kg染毒组坐骨神经上清中无变化；300mg／kgCS_2染毒组坐骨神经沉淀中μ-calpain的含量下降36.8％(P＜0.01)，而500mg／kg染毒组中升高35.9％(P＜0.01)。 5．HD和CS_2染毒大鼠神经组织中calpains总活性的变化 5．1 HD染毒大鼠神经组织中calpains总活性的变化与对照相比，大脑组织中calpains总活性仅在HD染毒第8周时下降37.2％(P＜0.01)；脊髓组织中calpains总活性在HD染毒第2、4和8周时分别下降22.8％、26.9％和27.5％(P＜0.01)，停止染毒16周后calpain活性恢复正常；坐骨神经中calpains总活性在HD染毒第2、4和8周以及停止染毒第16周后分别升高14％、20％(P＜0.05)、34％(P＜0.01)和18％(P＜0.05)。 5.2 CS_2染毒大鼠神经组织中calpains总活性的变化与对照相比，300、500 mg／kgCS_2染毒组脊髓组织中calpains总活性分别下降18.5％和20.6％(P＜0.01)，坐骨神经组织中calpains总活性分别上升15.5％和20.7％(P＜0.01)，而大脑中calpains总活性未发生显著变化。结论 1、HD、CS_2染毒引起大鼠中枢和周围神经组织中3种NF亚单位含量发生明显变化，其中NF-M和NF-L的变化较NF-H更加显著。 2、HD诱导的大鼠神经组织NF亚单位含量变化与其神经行为学改变之间存在高度相关性。 3、HD诱导的神经组织NF含量下降具有可逆性，并与HD中毒性神经病症状的恢复有关。 4、HD、CS_2染毒对不同神经组织中α-tubulin、β-tubulin和β-actin亚单位的影响不同。HD主要影响坐骨神经中α-tubulin、β-tubulin和β-actin的含量，而CS_2对中枢和周围神经组织中α-tubulin、β-mbulin和β-actin的含量均产生明显影响，其中β-tubulin的变化较α-tubulin和β-actin更加显著。 5、HD、CS_2对细胞骨架的六种成分的影响程度不同，其中NFs含量的变化比tubulins、β-actin显著。 6、HD染毒对神经组织中六种细胞骨架蛋白的mRNA表达未产生明显影响，而CS_2染毒影响了神经组织中六种细胞骨架蛋白的mRNA表达水平，表现为大脑组织中NF-L、NF-H和β-tubulin mRNA的转录水平下调，而脊髓组织中NF-H、NF-M、NF-L、β-tubulin和β-actin mRNA的转录水平上调。 7、HD、CS_2染毒影响了神经组织中calpains表达和活性，表现为中枢神经组织中calpains活性下降，坐骨神经中calpains活性升高。末梢轴索中calpains的激活可能与HD、CS_2诱导的神经丝含量下降有关。 8、毒物引起的神经组织中骨架蛋白改变参与了正己烷和CS_2中毒性周围神经病的发生。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2007
【分类号】：R363

【参考文献】