骨髓基质干细胞向肠神经元细胞分化的研究

发布时间：2019-05-05 14:42

【摘要】：第一部分 骨髓基质干细胞的分离、培养、纯化和鉴定 目的：观察大鼠骨髓基质干细胞在体外培养的条件及生物学特性并加以鉴定。 方法：取SD大鼠骨髓，分离培养骨髓基质干细胞(BMSC)，相差显微镜下观察其形态，传代后观察其生长特性，，用流式细胞方法加以鉴定。 结果：使用全骨髓细胞培养法，在含20％胎牛血清的L-DMEM培养，原代培养3-5d后，BMSC开始克隆生长，10-14d达到90％融合。传代培养至第6代，BMSC生长形态相对稳定，以梭形细胞为主，倍增时间约4天，90％融合时间约为10d。流式细胞检测第6代BMSC高表达BMSC标志CD90(99.7％)，而不表达造血细胞标志CD45表达阴性，纯度较高。 结论：使用全骨髓细胞培养法，在含20％胎牛血清的L-DMEM条件下培养，是分离培养BMSC的简单、快速方法，并可获得较高的纯度。 第二部分 骨髓基质干细胞体外向肠神经诱导分化 目的 探讨不同方法诱导大鼠骨髓基质干细胞分化肠神经细胞的可能性，并探索适宜的诱导方法。 方法 体外培养并鉴定大鼠骨髓基质干细胞(BMSC)。传代至第六代后，进行神经诱导分化。先以bFGF(10ng／ml)预诱导24h，然后分6组诱导：1)GDNF组 以胶质细胞源神经营养因子(GDNF，10ng／ml)，在胎肠培养基(FGCM)条件下诱导10天；2)维甲酸组 维甲酸、锌和FGCM诱导10天。3)GDNF、维甲酸、锌联合FGCM组4)单用GDNF组；5)单用FGCM组；6)DMEM对照组。并观察GDNF诱导的量效、时效关系，以及撤去诱导剂后神经表型的变化。免疫荧光法检测神经元标志神经特异性烯醇化酶(NSE)和神经丝蛋白(NF)，胶质细胞标志胶质纤维酸性蛋白(GFAP)，以及肠神经标志蛋白基因产物(PGP9.5)、神经型一氧化氮合酶(nNOS)。 结果 1)流式细胞检测BMSC高表达BMSC标志CD90，而不表达造血细胞标志CD45表达阴性。2)诱导10天后，各组不同程度部分细胞在形态上表现出神经元样改变，免疫荧光染色NSE、NF、PGPG9.5、NOS阳性，GFAP染色阴性。3)GDNF组NF、PGPG9.5、NOS阳性比例显著高于维甲酸组(p＜0.05)及单用GDNF或FGCM组。4)GDNF诱导存在量效和时效关系。5)撤去诱导剂后神经标志表达逐渐下降。 结论 BMSC可在体外被诱导分化为肠神经样细胞，GDNF在胎肠培养基条件下诱导肠神经样细胞比例高于维甲酸等的诱导。撤去诱导剂后，肠神经元表型不能长期维持。 第三部分 骨髓基质干细胞分化后肠神经递质的表达 目的 探讨骨髓基质干细胞体外向肠神经元细胞诱导后肠神经递质的表达和分泌。 方法 体外培养并鉴定大鼠骨髓基质干细胞(BMSC)。传代至第六代后，进行神经诱导分化。先以bFGF(10ng／ml)预诱导24h，然后分两组诱导：1)GDNF组 以胶质细胞源神经营养因子(GDNF，10ng／ml)，在胎肠培养基(FGCM)条件下诱导10天；2)维甲酸组 维甲酸(Vitamin A acid，VA，0.5mM)、锌(10μM)和FGCM诱导10天。免疫荧光法检测肠神经递质一氧化氮的合成酶(nitric oxide synthase，NOS)、血管活性肠肽(vasoactive intestinal polypeptide，VIP)、乙酰胆碱(acetylcholine，ACh)和P物 质(substance P，SP)。并用硝酸还原酶法检测培养液一氧化氮(nitric oxide，NO)水平。结果1)诱导10天后，GDNF组和维甲酸组均有部分细胞在形态上表现出神经元样改变，免疫荧光染色NOS、VIP阳性，SP、ACh表达水平较低，且GDNF组阳性率较维甲酸组高。2)两组培养液均可检测到NO，诱导10天后的浓度高于6天后的浓度，GDNF组高于维甲酸组。 结论 BMSC可在体外被诱导分化为肠神经样细胞并表达肠神经递质。 第四部分 大鼠骨髓基质干细胞分化前后神经营养因子的表达 目的 探讨大鼠骨髓基质干细胞分化前后神经生长因子表达的变化。 方法 体外培养大鼠骨髓基质干细胞(BMSC)，传代至第6代，进行神经诱导分化。先以bFGF(10ng／ml)预诱导24h，然后以胶质细胞源神经营养因子(GDNF，10ng／ml)或维甲酸、Zn在胎肠培养基(FGCM)条件下诱导10d。免疫荧光法检测肠神经元标志的表达。RT-PCR法检测神经营养因子GDNF和神经生长因子(NGF)mRNA的表达。 结果 诱导10天后，部分细胞在形态上表现出神经元样改变，免疫荧光染色肠神经元标志阳性。RT-PCR检测发现，BMSC诱导前低表达神经营养因子NGF和GDNF mRNA，而诱导后表达水平显著增加。 结论 GDNF不仅能在体外诱导BMSC分化为肠神经样细胞，而且能促进神经营养因子表达显著增加。 第五部分 骨髓基质干细胞肠神经元分化机制的初步研究 目的 初步探讨骨髓基质干细胞(bone marrow stromal cell，BMSC)肠神经分化的机制。 方法 体外原代培养胎肠细胞，检测神经营养因子胶质细胞细胞源神经营养因子GDNF和神经生长因子NGF的表达，并制备胎肠条件培养基(Fetal gut condition medium，FGCM)。观察GDNF受体GDNFRα1的抗体对GDNF、FGCM诱导BMSC肠神经分化的影响，以及RET基因mRNA的表达变化。 结果 胎肠原代培养细胞表达神经营养因子GDNF和NGF。GDNF、FGCM诱导BMSC肠神经分化后RET基因mRNA的表达上调。GDNFRα1的抗体可抑制BMSC肠神经分化，并下调RET基因mRNA的表达。 结论 GDNF可能在胎肠培养基提供的肠神经元发育微环境下，通过上调RET表达激活GDNF-RET信号通路，从而诱导BMSC向肠神经元细胞分化。
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【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2006
【分类号】：R329.2

【参考文献】

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本文编号：2469650