一种抗肿瘤蛋白基因在衣藻叶绿体中的重组与表达

发布时间：2019-05-15 03:14

【摘要】：我们实验室于1998年从蓝藻中克隆获得了别藻蓝蛋白基因(apc)。将该基因 重组到大肠杆菌表达质粒PET28a+中,实现了该基因在大肠杆菌中的高效表达。 纯化的产物(rAPC)经小鼠试验证实,不管是口服给药还是腹腔注射给药,微量的 该重组蛋白便可显著抑制S180肉瘤细胞和肝癌细胞,抑瘤率为40%-60%。但在 大肠杆菌中表达的重组蛋白存在后期的分离纯化繁琐,需要包涵体复性以及含有 大肠杆菌毒素等不利因素。由于rAPC口服给药有效,这提示我们可以开发一种 直接口服的治疗癌症的新药。由于植物表达系统具有高效表达外源目的基因、生 物安全性好、可以直接口服等特点,已成为生物反应器的热点之一。别藻蓝蛋白 基因来源于原核的蓝藻,密码子的偏好性等均具有原核性质,因此我们选择了用 衣藻叶绿体表达系统来表达这种药用蛋白。为进一步开发口服抗肿瘤药用蛋白奠 定基础。 本论文研究的第一部分探索了进行衣藻叶绿体转化所涉及的各种方法,如: 基因枪转化参数、筛选方法及对转化子的各种分子检测方法等。通过对以上方法 的探索,初步建立了利用同源重组方法在衣藻叶绿体中稳定表达外源基因的体 系。 本论文研究的第二部分构建了外源基因apc的衣藻叶绿体表达载体:papc-S, 并用基因枪法将该载体导入衣藻细胞,通过抗性筛选后,在壮观霉素抗性平板上 得到了15个墨绿色的衣藻转化子。经过三轮抗性筛选后,利用一对分别互补于 衣藻叶绿体chlL,基因5’端和外源基因apc 3’端的引物对转化子进行了PCR检测, 同时以apc基因为探针对转化子进行了酶切Southern检测,结果证实外源基因已 经定点整合到了衣藻叶绿体特定位点。以天然APC蛋白免疫兔获得的抗血清为 一抗,经Western杂交证实外源基因已在衣藻叶绿体中获得了表达,经定量ELISA 检测证实外源基因在衣藻中的表达量占可溶性总蛋白的2—3%。 由于在大肠杆菌中重组的别藻蓝蛋白β亚基的抗肿瘤活性大大高于完整的 重组的APC蛋白。因此论文研究的第三部分构建了别藻蓝蛋白β亚基的衣藻叶 绿体表达载体papc-B。用基因枪法将之导入衣藻细胞后,经各种分子水平的检
[Abstract]:The allophycocyanin gene (apc). Was cloned from blue algae in our laboratory in 1998. The gene was recombined into E. coli expression plasmid PET28a to realize the high expression of the gene in E. coli. The purified product (rAPC) was confirmed by mouse test that the recombinant protein could significantly inhibit S180 sarcomas and liver cancer cells by oral administration or intraabdominal injection, and the tumor inhibition rate was 40% 鈮，

本文编号：2477273