供者凋亡细胞诱导恒河猴同种异体肾移植免疫耐受的初步研究

发布时间：2019-06-18 10:26

【摘要】： 背景在过去的几十年里，由于免疫抑制剂的发展，不仅使器官移植成为终末期肾、肝、心脏疾病可接受的治疗方式，而且显著减少了急性排斥的发生率，同时显著提高了器官移植的短期、长期生存率。然而，免疫抑制剂的应用带来了许多问题。首先，要终身连续对免疫系统进行非特异性免疫抑制。第二，当前使用的免疫抑制剂中，没有一种能完全预防急性排斥或者慢性排斥。第三，免疫抑制剂的应用带来了肿瘤和感染的风险。第四，免疫抑制剂的应用增加了移植病人高血压的风险以及由此导致的心血管并发症。面对以上问题，新的免疫调节法增加了特异性，减少了这样的毒副作用。在最近，细胞治疗的研究取了显著的进步。特别是凋亡细胞的静脉输注能诱导实质器官的移植免疫耐受。在临床工作中，一些病人对移植物无限期地形成耐受，只须使用少量的免疫抑制剂，这说明在临床可以通过人工的方法诱导免疫耐受。我们的研究小组应用凋亡细胞诱导免疫耐受明显延长鼠心脏移植的存活时间，这一思路已经被国内外很多实验室所承认和重复。现已证明，在许多啮齿类小动物模型中，静脉输注凋亡细胞可以诱导供者特异性的移植免疫耐受，这给我们一个启示，在临床上是否也可以通过类似的方法诱导免疫耐受，从而有效延长移植物存活，减少免疫抑制剂的使用呢? 为了证明这个问题，我们首先选择非人类灵长类动物进行供体凋亡细胞诱导免疫耐受的研究。但是，在成功应用供体凋亡细胞诱导非人类灵长类动物移植免疫耐受之前，首先必须解决好以下几个问题：(1)测定恒河猴的类人血型；(2)要找到诱导恒河猴外周血单个核细胞凋亡的有效方法；(3)建立合适的与临床情况最相似、并且有利于免疫耐受研究的器官移植模型。许多文献报导传统的切除双肾的恒河猴肾移植模型术后因排斥反应、急性肾小管坏死等并症很容易导致恒河猴术后7-10天死亡，不利于免疫耐受的研究，因此，要建立有利于免疫耐受研究的恒河猴肾移植模型。本文对以上几个问题进行了研究，并初步研究了供者凋亡细胞对非人类灵长类动物同种异体肾移植移植物存活以及急性排斥反应的影响。目的研究恒河猴类人血型的检测方法；建立恒河猴同种异体肾移植模型；研究诱导恒河猴外周血单个核细胞凋亡的方法；研究供者凋亡细胞对恒河猴同种异体肾移植免疫耐受的诱导。方法 1、43只恒河猴，肌注氯胺酮麻醉后，分别抽取静脉血5ml，肝素抗凝。分别收集恒河猴唾液。应用常规单克隆抗体法、凝集抑制实验法(检测唾液)、抗A抗B凝集素检测法(反向定型法)共三种方法测定恒河猴的类人血型。 2、建立恒河猴同种异体肾移植模型：4只恒河猴随机配成两对，每只恒河猴均捐出左肾，保留右肾，同时接受另一只恒河猴的左肾移植。供肾切取：沿中线切开腹部，显露左肾。上血管夹前给予肝素(100u／kg，iv)。切下肾脏后用4℃HCA保存液50ml灌注。受者手术：沿中线切开腹部，游离腹主动脉和下腔静脉远端，上血管夹前静脉注射肝素(100u／kg，iv)。肾动脉、静脉分别于腹主动脉、下腔静脉远端行端侧吻合。血管吻合过程中应用显微外科器械、7／0无损伤血管缝合线。输尿管与膀胱吻合，并临时留置双猪尾支架管。术后给予阿司匹林100mg口服，共3天。术后采用亚临床剂量免疫抑制方案：甲基强的松龙+环磷酰胺+雷帕霉素。术中、术后一天、二天静脉注射甲基强的松龙均为120mg；环磷酰胺20mg，术前4天开始，每两日一次；雷帕霉素0.4mg，手术日开始，每日一次。术后抗生素：硫酸庆大霉素(10000u／kg／d，IM)。 3、在我们的研究中有一个重要的问题值得注意，即细胞凋亡后很容易发生继发性坏死，而坏死细胞对免疫的影响与凋亡细胞截然不同，因此在诱导细胞凋亡的同时应尽量减少坏死细胞。为此我们比较了高能X线法、Co60γ射线法、紫外线(UVC)照射法三种方法，发现紫外线(UVC)照射法效果最佳，因此我们对紫外线照射法进行了详细的研究，在不同的照射时间(40，50，60分钟)、照射距离(15，20，30厘米)、不同的小牛血清浓度(10％，15％，20％)、不同的液面高度(0.106，0.142，0.177厘米)等条件下的凋亡率，确定诱导恒河猴外周血单个核细胞凋亡的最佳条件。 4、供者凋亡的单个核细胞预输注诱导恒河猴同种异体肾移植免疫耐受：6只恒河猴随机配对分为两组，即凋亡组和对照组。凋亡组接受对照组配对供者的凋亡细胞。制备的凋亡细胞用20mlPBS液稀释后输注给凋亡组配对的受者。对照组输注PBS液20ml作为空白对照处理。每只恒河猴均接受对方左侧供肾，行肾移植术，保留右侧肾脏。 (1)大量凋亡的单个核细胞制备抽取供者恒河猴外周血50ml，应用淋巴细胞分离液分离单个核细胞，应用UVC法照射单个核细胞，诱导单个核细胞凋亡条件：培养皿直径为6cm，10％小牛血清培养基4ml，照射距离20cm，照射时间为60分钟。制备凋亡细胞后应用流式细胞计数仪检测凋亡率，同时静脉输注给受者猴，7天后行同种异体肾移植术。 (2)术后免疫抑制剂的方案同前。 (3)术后动态监测血常规、雷帕霉素浓度、CD4+CD25+调节性T细胞；定期行移植肾B超、CT检查和移植肾穿刺病理检查，观察移植肾存活时间。结果 1、应用常规单克隆抗体法检测恒河猴类人血型没有一例出现阳性凝集反应，不能检测出恒河猴类人血型。凝集抑制实验(检测唾液)检测恒河猴唾液类人血型也未出现阳性反应。所以，单克隆抗体法、凝集抑制实验法均不能检测出恒河猴类人血型。抗A抗B凝集素检测法(反向定型法)能测出每只恒河猴的类人血型。43只恒河猴中类人A型3只(7％)，类人B型25只(58.14％)，，类人AB型15只(34.88％)。而未发现类人O型。 2、四只恒河猴左肾的切取和肾移植手术时间平均在两小时内完成，肾移植手术均成功，开放血流后移植肾即恢复功能，开始泌尿，术中尿量多，说明移植肾进入多尿期。术后二天移植肾彩超检查示移植肾血供良好。移植肾存活的时间分别为5，5，6，7天。移植肾均出现强烈的急性排斥反应。术后未出现血肿、感染、尿瘘、输尿血管梗阻等并发症。其中一只恒河猴移植肾出现肾动脉栓塞，移植肾存活5天；存活7天的恒河猴因肠梗阻而死亡。其余的猴切除排斥肾脏后均存活。与正常肾比较，术后移植肾明显肿大，穿刺病理和移植肾切除病理示移植肾有许多炎性细胞浸润，局灶性坏死。 3、由于在前期研究中发现紫外线(UVC)照射法明显优于高能X线法和Co60γ射线法，因此我们对紫外线诱导方法进行了深入探讨。发现影响细胞凋亡的主要因素有：照射距离、照射时间、培养液的量、小牛血清浓度。对UVC照射法重复研究，发现照射距离20厘米的凋亡率显著高于照射距离30厘米的凋亡率(P＜0.0001)、照射60分钟的凋亡率显著高于40、50分钟的凋亡率(P＜0.01)，而其坏死率不超过10％、直径6cm的培养皿中培养液4ml时的凋亡率显著高于培养液5ml时的凋亡率(P＜0.01)，而其坏死率显著低于培养液3ml时的坏死率(P＜0.05)、用10％的小牛血清培养液时的凋亡率显著高于用15％、20％的小牛血清培养液时的凋亡率(P＜0.005)。 4、供者凋亡细胞预输注后恒河猴同种异体肾移植结果： 4(1)、恒河猴外周血50ml，可分离出单个核细胞数为8×10~7-8.5×10~7个，经UVC照射后获取的细胞总数(即为静脉输注的细胞总数)为7.2×10~7-7.5×10~7个。其凋亡率为40-60％，坏死率为5-10％。 4 (2)、移植肾存活时间：凋亡组为7(手术原因死亡)，19，30天，对照组为5(移植肾动静脉血管栓塞)，6，14天。 4 (3)、凋亡组：99523术后6天B超示移植‘肾血流不丰富，移植肾轻度肿大，大小53×25×35mm，活检病理示急性排斥。术后7天死亡，死亡原因为肠梗阻，其诱因是手术中结扎了肠系膜下动脉。97387和00209术后7天B超示移植肾血流丰富，移植肾大小和结构正常，大小分别为41×28×32mm、52×24×38mm，活检病理见少量淋巴细胞浸润。对照组：99581术后5天行移植肾B超检查，发现移植肾明显肿大，大小约55×25×40mm。活检病理检查显示移植肾大量淋巴细胞浸润，广泛局灶性的坏死。98447术后5天行B超检查示移植肾大小为：43×18.3×37mm，无血供；即行移植肾CT检查，静注造影剂后，移植肾不显影，说明移植肾无血供。手术探查切除移植肾，术中见移植肾呈紫黑色，肾动脉无搏动。肾动脉有血栓形成。切除移植肾送病理检查显示移植肾坏死。00473术后7天行B超检查示移植肾结构正常，大小为53×41×39mm，移植肾血流丰富，穿刺活检病理见少量淋巴细胞浸润。术后14天复查移植肾B超示血流丰富，阻力指数0.74。活检病理见大量淋巴细胞浸润。 4 (4)、CD4+CD25+淋巴细胞亚群的监测：凋亡组受者97387、00209的CD4+CD25+的百分率在术前为3.49％和3.19％；术后一周达到高峰，分别为11.79％和13.58％，约是术前的3-4倍。对照组00473的CD4+CD25+在术前、术后相对稳定。结论 1、本研究对比了单克隆抗体法、凝集抑制实验法和抗A抗B凝集素检测法(反向定型法)检测恒河猴类人血型的情况，实验结果显示反向定型法测定恒河猴类人血型敏感，有效；恒河猴类人血型分布以B型最多(58.14％)，AB型次之(34.88％)，A型最少(7％)；而无类人O型。而单克隆抗体法和凝集抑制实验法不能检测恒河猴类人血型。 2、保留一侧肾的恒河猴肾移植模型与以往模型相比有以下优势：(1)保留了受体的原肾，更见符合临床情况，因为在临床上对于受体原肾均不予切除，这样不但可以减少创伤，而且更有利于术后恢复；(2)保留原肾更加有利于术后维持内环境的稳定，减少围手术期护理的难度；(3)移植物排斥时，将排斥的移植物切除后受体猴可以长期存活，这不但更好地模拟了临床情况，而且减少了受体猴不必要的死亡，更加符合动物的伦理学；(4)由于受体猴能够长期存活，更有利于我们长期对受体猴进行免疫学的长期随访观察，是我们进行免疫耐受研究的良好模型。 3、诱导恒河猴外周血单个核细胞凋亡，紫外线照射法比高能X线和γ射线法敏感，效果好。紫外线照射诱导恒河猴外周血单个核细胞凋亡的最佳条件是用含10％小牛血清的1640培养液，直径6cm的培养皿中加培养液4ml，照射距离20cm，照射时间为60分钟。 4、凋亡组的移植肾存活时间比对照组长，说明可能存在部分免疫耐受，但是，凋亡组和对照组均出现急性排斥反应，说明术前输注供者的凋亡细胞没有诱导出完全的免疫耐受。 5、凋亡细胞输注可诱导CD4+CD25+T调节细胞升高。凋亡组的CD4+CD25+T调节细胞升高可能是移植肾存活时间延长的原因。
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【学位授予单位】：第一军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2007
【分类号】：R699;R392

【参考文献】