人胚胎生殖细胞的原代、传代培养及生物学鉴定

发布时间：2019-07-18 06:53

【摘要】： 目的:鉴定组织块培养法体外培养人胚胎生殖腺嵴和背侧肠系膜所获得的细胞为未分化的人胚胎生殖细胞(人EG细胞);尝试不同时间和不同方法对人EG细胞进行传代培养,探讨最佳传代时机和传代方法;并确定传代培养的细胞仍为未分化的人EG细胞。方法:取5～10周人胚胎生殖腺嵴和背侧肠系膜,用源于自身胚胎组织的成纤维细胞作为饲养层,在不添加任何细胞因子条件下进行组织块培养。以免疫细胞化学法检测培养细胞中SSEA-1、SSEA-3、Oct-4、端粒酶的表达;利用流式细胞术检测所得细胞中人EG细胞的比例。对原代培养第八天和第16天的细胞采用挑出传代法、消化传代法传代培养,其中消化传代法使用的三种消化液分别是0.25%胰蛋白酶、0.5%胰蛋白酶和0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA。检测传代培养后细胞中SSEA-1、SSEA-3、Oct-4、端粒酶的表达。结果:原代培养的细胞生长良好,免疫细胞化学检测显示,位于饲养层上的细胞及细胞集落阳性表达SSEA-1、SSEA-3、Oct-4、端粒酶;流式细胞术检测表明,培养体系中人EG细胞比例约为13%。原代培养至第八天时,细胞生长最旺盛,适合于传代;第16天时,很多人EG细胞集落已分化或消散,丧失了传代的能力。使用胰蛋白酶-EDTA作为消化液消化传代人EG细胞所得的集落最多,效果最佳。通过免疫细胞化学方法检测表明,传代培养第五代细胞仍保持SSEA-1、SSEA-3、Oct-4、端粒酶的阳性表达。结论:组织块培养法原代培养人胚胎生殖腺嵴和背侧肠系膜所获得的细胞为未分化的人EG细胞。最适宜的传代时间是原代培养后第八天,最佳的传代方法是胰蛋白酶-EDTA消化法,且传代培养后的细胞仍为未分化的人EG细胞。
【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2006
【分类号】：R321

【引证文献】